Targeted metabolomics를 이용한 약물 대사 경로 규명

LC-MS/MS 기반 kinetic profiling 전략

Targeted metabolomics를 이용한 약물 대사 경로 규명

1. 서론 – “Metabolite는 순간의 흔적이 아니라, 반응의 방향이다”

신약 후보 물질이 체내에서 어떻게 대사되는지를 이해하는 건 단순한 독성 예측의 문제가 아니다.
대사체는 단순히 ‘분해 산물’이 아니라, 시간과 효소의 상호작용이 남긴 흔적이다.

즉, metabolite profiling은 정적인 스냅샷이 아니라 동적인 경로 해석 도구다.
그래서 최근 약물 분석 분야에서는 untargeted metabolomics보다
targeted LC-MS/MS 기반 kinetic profiling이 주목받고 있다.

Targeted metabolomics는 미리 정의된 대사체(예: parent drug, Phase I/II metabolite)를
정량적 precision을 가지고 시간별로 추적함으로써,
대사 속도, 효소 포화, pathway preference를 실질적으로 모델링할 수 있다.

2. Targeted vs. Untargeted metabolomics

 

구분	Untargeted	Targeted
목적	전체 대사체 pool 탐색, pattern discovery	특정 약물 및 대사체 정량
분석기기	HRMS (Orbitrap, Q-TOF)	Triple quadrupole LC-MS/MS
정량 정확도	상대적 (semi-quantitative)	절대적 (absolute)
응용 영역	biomarker discovery	drug metabolism, PK/PD 연계
데이터 규모	수백~수천 metabolite	수~수십 metabolite
주요 산출물	PCA, volcano plot	concentration-time curve, kinetic parameter

대사 경로 규명 목적이라면 untargeted 분석은 탐색 단계에서만 유효하다.
결국 약물의 fate를 모델링하려면,
각 metabolite를 실제 농도 단위(ng/mL)로 정량할 수 있어야 한다.
그게 바로 LC-MS/MS 기반 targeted metabolomics의 역할이다.

3. LC-MS/MS 기반 Targeted Metabolomics Workflow

약물 대사 경로 규명을 위한 LC-MS/MS 기반 워크플로는 아래와 같이 구성된다.

1️⃣ Analyte selection – parent drug 및 known metabolites 정의
2️⃣ Standard synthesis/confirmation – reference compound 확보
3️⃣ Method development – MRM transition, retention, matrix 검증
4️⃣ Sample collection – in vitro (microsome, hepatocyte) 또는 in vivo time-course
5️⃣ Quantitative LC-MS/MS analysis
6️⃣ Kinetic modeling (Vmax, Km, CLint 등)
7️⃣ Pathway reconstruction (enzyme & metabolite flow)

이 중 4~6단계, 즉 시간대별 농도 profiling과 kinetic modeling이
‘대사 경로 규명’의 핵심이다.

4. In vitro 대사 시스템 선택 – microsome, S9, hepatocyte

4.1 Liver microsome

• 주로 Phase I oxidation (CYP-mediated) 반응 평가
• NADPH 의존성
• 빠른 반응 속도 → high-throughput screening에 적합

4.2 S9 fraction

• microsomal + cytosolic enzyme 모두 포함
• Phase I + Phase II 동시 관찰 가능
• UDPGA, PAPS 등 cofactor 추가 필요

4.3 Hepatocyte

• full cellular metabolism 모델
• uptake, efflux, conjugation 모두 반영
• 단점: variability, viability 이슈

실무적으로는 microsome → S9 → hepatocyte 순으로 검증 범위를 확장하며,
대사체 생성을 LC-MS/MS로 시계열 추적한다.

5. LC-MS/MS 기반 kinetic profiling 설계

5.1 Sampling time point 설정

• 초기 fast phase (0, 2, 5, 10, 20 min)
• 후기 slow phase (30, 60, 120, 240 min)
• 반응 곡선의 선형 및 포화 구간을 모두 포착해야 함

5.2 Internal standard 적용

• Stable isotope-labeled (SIL) IS를 사용
• matrix effect 및 extraction recovery 보정
• 특히 conjugate metabolite(예: glucuronide, sulfate)는 matrix effect가 크므로
  isotope-labeled conjugate IS 확보가 이상적

5.3 Protein precipitation (PPT) vs. SPE

• Microsomal incubation sample은 PPT(MeOH, ACN)로 충분
• Hepatocyte supernatant는 matrix effect 커서 SPE 필요
• LC column contamination 방지 위해 phospholipid removal cartridge 적용

6. LC-MS/MS 조건 최적화 – MRM 기반 정량 분석

6.1 MRM transition 설정

• Parent, hydroxylated, demethylated, glucuronidated 등 metabolite별 precursor/product ion 선정
• polarity mode 혼합 사용 (+/– switching)
• dwell time 최소화로 cycle time < 0.5 s 확보

6.2 Retention & separation

• Phenyl-hexyl, C18, HILIC column 병행
• isomeric metabolite 분리 필수 (예: O- vs N-demethylated form)
• short gradient (<10 min) 조건에서 reproducibility 확보

6.3 Calibration & QC

• matrix-matched calibration curve
• intra/inter-day CV <15% 기준
• bench-top/extract stability 확인 (autosampler 48 h 기준)

7. Data interpretation – 대사 kinetic 모델링

LC-MS/MS로 얻은 시간별 농도 데이터는
Michaelis–Menten 식을 기반으로 kinetic parameter를 도출할 수 있다.

식:
v = (Vmax × [S]) / (Km + [S])

여기서,

• v: 대사 속도
• [S]: substrate 농도
• Km: 효소의 친화도
• Vmax: 최대 반응 속도

시간별 metabolite 농도 데이터를 fitting하면,
대사 생성속도, 효소 포화 구간, pathway 분기점을 파악할 수 있다.

7.1 Example – CYP-mediated oxidation

Parent drug A → Hydroxy-A → Glucuronide
Microsomal incubation 결과:

 

Time (min)	Parent (%)	Hydroxy-A (ng/mL)	Glucuronide (ng/mL)
0	100	0	0
10	65	35	5
30	40	55	15
60	20	70	35
120	5	60	50

Interpretation:

• Hydroxylation 반응이 0–30분 구간에서 빠르게 증가 → CYP 주효소 관여
• 이후 Glucuronide 생성 증가 → Phase II 전환
• Hydroxy-A 농도 plateau → turnover rate saturation

이런 kinetic curve를 통해 대사 경로 흐름(drug → M1 → M2)를 정량적으로 재구성할 수 있다.

8. Multi-pathway kinetic profiling

대부분의 약물은 단일 경로로만 대사되지 않는다.
예를 들어, drug B는 아래와 같은 복합 경로를 가진다고 하자.

• Drug B → M1 (CYP3A4)
• Drug B → M2 (CYP2D6)
• M1 → M3 (UGT1A1)

Targeted metabolomics에서는 각 metabolite별 kinetic curve를 비교해
major vs. minor pathway를 구분할 수 있다.

이때 “metabolite ratio (M/P ratio)”를 이용하면 효소 기여도를 간접 추정할 수 있다.

Time (min)M1/PM2/PM3/M1

 

Time (min)	M1/P	M2/P	M3/M1
10	0.2	0.05	0
30	0.5	0.1	0.05
60	0.8	0.2	0.2
120	1.0	0.3	0.4

→ CYP3A4 경로(M1)가 major route임을 확인
→ Phase II 전환(M3 생성)이 late-phase 반응으로 이어짐

이런 kinetic ratio 분석은 DDI(약물상호작용) 예측에도 직접 연결된다.

9. In vivo kinetic profiling

In vitro 결과는 효소 활성을 반영하지만,
in vivo에서는 흡수–분포–대사–배설(ADME) 요인들이 동시에 작용한다.

따라서 실제 대사 경로를 입증하려면
동물 plasma 또는 urine sample 기반의 time-course 분석이 필요하다.

9.1 Plasma concentration-time profile

• Parent와 major metabolite 동시 모니터링
• Tmax, Cmax, AUC 비교
  → systemic exposure와 대사율 평가

9.2 Urine metabolite profile

• 배설 경로 확인 (renal vs biliary)
• conjugated metabolite 비율 평가

예시:
Glucuronide/Parent ratio가 plasma에서는 0.3, urine에서는 5.0이라면,
→ hepatic conjugation + renal excretion이 주요 route로 해석된다.

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10. Data integration – kinetic network reconstruction

Targeted metabolomics 결과를 바탕으로
대사 네트워크를 그래프로 시각화하면 pathway 흐름이 명확해진다.

예를 들어, LC-MS/MS 기반 quantitative data를 Cytoscape이나 SIMCA로 매핑하면,

• node = metabolite
• edge = reaction rate
  으로 표현된다.

이걸 통해 어떤 경로가 time-dependent로 활성화되는지,
어떤 branch가 saturation에 도달하는지를 직관적으로 파악할 수 있다.

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11. 국내 제약사 적용 사례

제약사	적용 플랫폼	특징
대웅제약	hepatocyte-based targeted metabolomics	신규 대사체 검증 및 DDI 예측
JW중외제약	rat plasma kinetic metabolomics	metabolite AUC 기반 bioequivalence 평가
유한양행	PBPK 모델링 연계	in vitro–in vivo extrapolation (IVIVE) 구축
한미약품	LC-MS/MS 기반 metabolite kinetic profiling	비임상 대사체 mapping 및 CYP 효소 동정

이들 기업은 LC-MS/MS 기반 metabolomics 데이터를
단순 reference가 아니라,
PK modeling과 mechanistic understanding을 연결하는 핵심 데이터로 활용하고 있다.

12. 향후 확장 방향 – multi-omics integration

Targeted metabolomics는 이미 LC-MS/MS 플랫폼에서 안정화된 영역이다.
하지만 최근에는 다음과 같은 확장 방향이 나타나고 있다.

1️⃣ Transcriptomics 연계:
CYP, UGT 등 대사 효소 발현량과 kinetic data 통합
→ enzyme expression–activity correlation

2️⃣ Proteomics 기반 absolute enzyme quantification:
Liver microsome 내 각 CYP isoform 농도를 정량해
CLint 예측 정확도 향상

3️⃣ Machine learning 기반 kinetic curve fitting:
Time-series data를 AI 모델에 학습시켜
Vmax, Km 자동 추정 (nonlinear regression 보정 포함)

4️⃣ Digital twin 적용:
in vitro–in vivo metabolic fate를 시뮬레이션하는
virtual patient model로 확장 가능

13. 결론 – “Targeted metabolomics는 약물의 시간 축을 시각화하는 기술이다”

결국 LC-MS/MS 기반 targeted metabolomics는
‘정량 데이터로 약물의 운명을 해석하는’ 접근이다.

단순히 metabolite를 찾는 게 아니라,
각 대사체가 언제, 어떤 효소에 의해, 어떤 속도로 만들어지는지를
수치적으로 모델링할 수 있다는 점이 가장 큰 강점이다.

분석팀 관점에서 말하자면 —
이건 단순 분석이 아니라 “시간에 대한 정량적 해석”이다.
즉, method validation이 아니라 “metabolic storytelling”을 위한 데이터 구축 과정이다.

“Metabolite profiling은 반응의 순간을 잡는 것,
Kinetic profiling은 반응의 과정을 해석하는 것이다.”