제약회사 연구원의 블로그

LC-MS/MS가 아무리 좋아도 내부 표준이 틀리면 정량은 흔들린다Metabolomics 분석을 처음 시작하면 대부분의 관심은 질량분석기(MS)에 집중된다.어떤 장비를 사용하는가.Orbitrap인가, QTOF인가, Triple Quad인가.Resolution은 얼마인가.Mass accuracy는 어느 수준인가.물론 모두 중요하다.하지만 실제 정량 데이터를 오래 다루다 보면 연구자들은 조금 다른 사실을 깨닫게 된다.좋은 데이터와 나쁜 데이터를 가르는 가장 큰 차이 중 하나는 의외로 내부 표준(Internal Standard, IS) 선택에서 시작된다는 점이다.실제로 LC-MS/MS 기반 정량 분석에서 가장 위험한 상황은 장비가 고장 난 경우가 아니다.오히려 장비는 정상적으로 동작하고 있는데 내부 표준이 분..

Proteomics에서 존재하지 않던 biology가 만들어지는 순간Proteomics 데이터를 분석하다 보면 어느 순간 반드시 마주치는 문제가 있다. Missing value다.어떤 protein은 control에서는 잘 보이는데 disease에서는 비어 있고, 어떤 peptide는 replicate 중 절반만 존재하며, low abundance signaling protein은 거의 랜덤하게 사라지는 것처럼 보인다. 처음 raw matrix를 보면 데이터가 구멍 난 스펀지처럼 느껴질 정도다.그리고 대부분의 분석은 여기서부터 시작된다.“빈칸을 어떻게 채울까?”많은 사람들은 imputation을 단순한 preprocessing 정도로 생각한다. 통계를 위해 비어 있는 칸을 적절한 값으로 채우는 과정이라고..

— 같은 시간에 나온다는 이유만으로, 어떤 신호는 사라지고 어떤 신호는 과장된다데이터를 보다 보면이상한 패턴을 만나는 순간이 있다.어떤 peptide는 항상 값이 낮고어떤 peptide는 특정 조건에서만 갑자기 튀고replicate 간 변동이 유독 큰 구간이 있다처음에는 이렇게 생각한다.“샘플 준비 문제인가?”“기기 상태가 불안정한가?”하지만 chromatogram을 자세히 보면공통된 특징이 하나 보인다.👉 피크들이 겹쳐 있다이때부터 문제는 명확해진다.Co-elutionCo-elution은 단순한 ‘분리 실패’가 아니다많은 사람들이 co-elution을이렇게 생각한다.“LC 분리가 덜 된 상태”그래서 해결책도 단순하다.gradient 늘리기column 바꾸기하지만 실제 문제는그보다 훨씬 깊다.Co-el..

— 우리는 농도를 측정하는 걸까, 아니면 경쟁에서 살아남은 신호를 보고 있는 걸까데이터를 보다 보면 이런 순간이 온다.같은 샘플인데 intensity가 다르고replicate 간 변동이 예상보다 크고어떤 peptide는 갑자기 사라진다처음에는 이렇게 생각한다.“기기가 불안정한가?”“샘플 준비가 잘못됐나?”하지만 반복해서 보면이상한 패턴이 하나 보이기 시작한다.👉 특정 peptide들이 항상 같이 흔들린다이 순간부터문제는 다른 방향을 가리킨다.Ion suppressionion suppression은 ‘오류’가 아니라 ‘기본 동작’이다많은 사람들이 ion suppression을예외적인 문제처럼 생각한다.하지만 실제로는 그렇지 않다.ESI 기반 LC-MS에서는👉 ion suppression은 항상 존재한다..

— 우리는 같은 샘플을 분석하는 걸까, 아니면 다른 샘플을 만들어내고 있는 걸까처음에는 단순한 의도로 시작한다.“gradient를 조금만 바꿔보자”60분 → 90분shallow → steepstarting %B 약간 조정이건 흔한 최적화 과정이다.오히려 당연한 단계다.그런데 결과를 보고 나면생각보다 당황하게 된다.검출되는 단백질 수가 달라지고peptide 패턴이 바뀌고differential expression 결과까지 달라진다이 순간 질문이 생긴다.“같은 샘플인데 왜 결과가 바뀌는 걸까?”LC gradient는 단순한 분리 조건이 아니다많은 사람들이 LC gradient를이렇게 생각한다.“분리를 조금 더 잘하기 위한 설정”하지만 실제로는 훨씬 더 큰 역할을 한다.LC gradient는어떤 peptide가..

— 환자의 상태가 아니라, 샘플의 변화가 결과를 만들고 있을 수도 있다임상 연구에서 metabolomics를 적용하면항상 기대가 크다.질병 특이적 biomarker 발견치료 반응 예측환자 stratification데이터는 화려하다.통계적으로 유의미한 결과도 나온다.그런데 어느 순간이상한 일이 발생한다.다른 병원에서 같은 연구를 했는데결과가 재현되지 않는다.또는같은 cohort에서도batch에 따라 결과가 달라진다.이때 대부분 이렇게 생각한다.환자군 차이인가분석 장비 차이인가하지만 실제 원인은훨씬 더 단순한 곳에 있는 경우가 많다.샘플이 이미 변해버렸기 때문이다.1. 임상 샘플은 ‘통제되지 않는 변수의 집합’이다실험실 샘플과 달리임상 샘플은 완전히 통제할 수 없다.채혈 시간 다름공복 여부 다름약물 복용 상..

— 우리는 샘플을 분석하는 것이 아니라, 이미 ‘가공된 결과’를 해석하고 있다처음 metabolomics 실험을 설계할 때많은 사람들이 이렇게 생각한다.“전처리는 그냥 준비 단계 아닌가?”단백질 제거하고추출하고정리해서 LC-MS에 넣는다분석의 핵심은LC-MS라고 믿는다.하지만 몇 번의 프로젝트를 지나고 나면이 생각은 완전히 바뀐다.같은 샘플을 사용했는데전처리 방법만 바꿨을 뿐인데결과가 완전히 달라지는 순간을 경험하기 때문이다.어떤 경우에는결론 자체가 뒤집힌다.그때 깨닫게 된다.문제는 분석이 아니라,이미 전처리에서 시작되었다는 것.1. 전처리는 ‘손실’과 ‘선택’의 과정이다전처리는 단순히 샘플을 정리하는 과정이 아니다.이건 본질적으로 두 가지를 동시에 수행한다.무엇을 남길 것인가무엇을 버릴 것인가즉,전처리..

— 우리는 같은 샘플을 분석하고 있는 것이 아닐지도 모른다처음 LC-MS를 다루기 시작했을 때,가장 이해하기 어려웠던 순간이 있다.같은 샘플을 분석했는데결과가 다르게 나오는 순간이다.처음에는 이렇게 생각한다.“장비 상태가 안 좋은가?”“샘플이 변했나?”하지만 시간이 지나면서조금씩 다른 결론에 도달하게 된다.문제는 샘플이 아니라조건이었다.그리고 더 놀라운 사실은 이것이다.LC-MS에서 조건 하나만 바뀌어도우리는 사실상 ‘다른 데이터를 보고 있는 것’과 같다.1. LC-MS는 측정 장비가 아니라 ‘필터’다많은 사람들이 LC-MS를“농도를 측정하는 도구”라고 생각한다.하지만 실제로는 다르다.LC-MS는모든 것을 보여주는 장비가 아니라일부만 선택해서 보여주는 필터다.이 필터는 다음 요소로 구성된다.chromat..