Column aging에 따른 retention shift 관리 – LC-MS/MS 장기 reproducibility 확보 전략

Column aging에 따른 retention shift 관리 – LC-MS/MS 장기 reproducibility 확보 전략

 

1. 서론 – “칼럼은 소모품이 아니라, 데이터의 신뢰성을 좌우하는 생체 기관이다”

LC-MS/MS 분석을 하다 보면 누구나 한 번쯤 이런 경험을 한다.
“어제까지 retention time(RT)이 3.2분이었는데, 오늘은 3.5분으로 밀렸다.”
칼럼이 깨진 것도 아니고, mobile phase도 그대로인데 왜 이런 일이 벌어질까?

그 이유는 단순하다.
Column은 시간이 지남에 따라 노화(aging)한다.
즉, stationary phase의 화학적 특성과 표면 활성도가 변하면서
분리(selectivity)와 보유(retention)가 서서히 달라지는 것이다.

이 현상은 단순히 RT shift에 그치지 않는다.
정량 분석에서는 calibration curve의 slope가 미묘하게 변하고,
MRM transition 간의 분리도가 무너져 cross-talk가 발생하기도 한다.

결국 column aging 관리는 LC-MS/MS의 장기 reproducibility를 보장하는 핵심 요인이다.
이 글에서는 column aging의 원인, 평가 방법, 그리고 이를 최소화하기 위한
실제 분석팀 레벨의 전략들을 정리해본다.

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2. Column aging의 주요 원인

Column 노화는 단순히 “오래 써서 생기는 문제”가 아니다.
그 내부에는 여러 화학적·물리적 요인이 복합적으로 작용한다.

원인 구분	주요 메커니즘	분석 영향
Silica degradation	고pH mobile phase(>8)에서 silica backbone 용출	Retention 감소, peak tailing
Bonded phase cleavage	고온·산성 조건에서 C18/C8 ligand 절단	Selectivity 변화
Fouling by matrix	단백질, 인지질, 염류 축적	Backpressure 증가, peak broadening
Phase collapse	100% aqueous 환경에서 C18 chain collapse	Polar compound retention shift
Mechanical wear	압력 fluctuation, bubble로 인한 packing 불균일	Reproducibility 저하

특히 bioanalytical sample (plasma, urine, tissue)을 다루는 경우
단백질과 인지질(fosfolipid)에 의한 column fouling이 가장 흔한 노화 요인이다.
이는 cleaning으로 완전히 복구되지 않으며, 결국 retention drift로 이어진다.

3. Retention shift의 패턴과 조기 징후

Column aging으로 인한 retention shift는 보통 세 가지 패턴으로 나타난다.

1️⃣ Retention time 전반적 감소
→ C18 chain의 ligand cleavage, silica 용출에 의한 hydrophobicity 저하
→ “모든 피크가 앞당겨짐” 현상 발생

2️⃣ 특정 analyte만 shift
→ matrix adsorption 혹은 ion-pairing 성분의 column surface interaction
→ 구조적 특성이 유사한 compound끼리 selectivity 왜곡

 

3️⃣ Retention time 불안정 (drift)
→ column void 형성, inlet frit 오염
→ 재현성 불량으로 QC sample에서 %CV 증가

이러한 RT drift는 처음엔 ±0.05분 수준이지만,
몇 백 인젝션 이후엔 ±0.2~0.3분까지 확산된다.
이는 gradient delay 및 MRM dwell time에 영향을 주어
quantitation reproducibility 저하로 직결된다.

4. Column 수명 평가의 실제 지표

Column의 “수명”은 단순히 injection 횟수로 정의할 수 없다.
실제 분석팀에서는 다음 네 가지 지표로 aging을 판단한다.

평가 항목	기준 지표	권장 수명 한계
Retention time stability	±2% 이내 유지	±0.1~0.2 min 이상 변동 시 교체 검토
Theoretical plate number	초기 대비 80% 이하 시 교체	효율 저하 확인용
Peak tailing factor	1.0~1.5 이상으로 증가 시	결합기 degradation 의심
Backpressure	초기 대비 30% 이상 상승	frit or packing contamination

분석팀에서는
column batch별로 이러한 품질지표(QC metric)를 DB화하여
분석 reproducibility log로 관리한다.
특히, stability study나 long-term TDM 분석에서는
column aging에 따른 bias를 통계적으로 교정하기도 한다.

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5. Column 관리의 기본 – “Preventive care”의 중요성

column aging을 늦추는 핵심은 사전 관리(preventive maintenance)다.
분석을 마친 후 mobile phase를 단순히 “종료”하는 수준이 아니라,
칼럼 내부의 화학적 상태를 재정비해야 한다.

5.1 Column flushing

• 매 분석 종료 후:
  → 50:50 water:MeOH 또는 MeOH:IPA (1:1)로 20 column volume 세척
• 주 1회:
  → 100% IPA 10 CV + 100% ACN 10 CV
  → 인지질 잔류 matrix 제거
• 고염 시료 사용 시:
  → 0.1% FA aqueous flush 후 organic phase로 전환

5.2 Storage condition

• 사용 중지 시:
  → 100% ACN으로 채워 보관
  → 냉장 보관 금지 (silica 침전 가능성)

5.3 Guard column 사용

• Bioanalytical LC에서는 guard column이 실질적으로
  main column 수명을 2~3배 연장한다.
  특히 plasma sample에서는 phospholipid filter (e.g., Phenomenex KrudKatcher)
  삽입이 retention drift를 현저히 완화시킨다.

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6. Column regeneration – “되살릴 수 있는 노화는 분해가 아니다”

Column performance가 저하되었을 때, 완전 교체 전에 시도할 수 있는
regeneration protocol이 있다.
단, 이는 column chemistry에 따라 제한적으로 적용된다.

6.1 Reverse flushing

• flow direction을 반대로 하여 packing 상단의 오염 제거
• 특히 protein이나 buffer salt 축적 시 효과적

6.2 Solvent wash sequence

1️⃣ Water → MeOH (50:50)
2️⃣ MeOH → IPA (1:1)
3️⃣ IPA → CHCl₃ (optional)
4️⃣ CHCl₃ → MeOH → ACN (100%)
→ 극성/비극성 오염물 모두 제거

6.3 pH gradient wash

• low pH (0.1% FA) → high pH (0.1% NH₄OH)로 교차 세척
• acidic/basic compound 잔류에 의한 RT drift 완화

이 과정을 통해 약 70% 이상의 retention recovery가 가능하다.
단, silica 용출이 진행된 상태에서는 복구 불가다.

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7. Column batch variation 관리

Column aging보다 더 까다로운 문제는 column batch 간 selectivity 차이다.
같은 브랜드, 같은 specification이라도 batch-to-batch variation으로
RT가 ±0.2~0.3분씩 달라지는 경우가 있다.

이를 제어하기 위해 한미약품 분석팀에서는 다음과 같은 전략을 쓴다.

1️⃣ Batch certificate 사전 확보
→ 제조사에서 제공하는 test mix chromatogram 확인

2️⃣ System suitability test (SST)
→ 기존 column과 신규 column에서 동일 SST sample injection 후 RT/peak ratio 비교
→ RT ratio ±2% 이상이면 batch mismatch로 판정

3️⃣ Calibration shift 보정
→ 신규 column 사용 시 calibration 재작성 (partial validation 수행)

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8. Case study ① – Anticancer compound의 RT drift

항암제 candidate A (logP 2.8, weak base)를 LC-MS/MS로 분석하던 중,
약 600 injection 이후 RT가 2.95분 → 3.45분으로 점진적 증가.
동시에 QC sample의 accuracy가 95% → 107%로 변동.
이유는 column surface의 ligand cleavage와 minor fouling 동시 발생.

대응 전략:

• column reverse flush + 100% IPA regeneration 수행
• guard column 추가
• 신규 column으로 partial validation 수행
  → RT 안정화 (±0.05분), QC within ±5%

9. Case study ② – Peptide-like compound의 early elution

중간극성 peptide 계열 compound 분석 중,
analyte RT가 4.8분 → 3.7분으로 감소.
mobile phase pH를 조정해도 개선되지 않음.

원인 분석 결과:
bonded phase cleavage에 의한 hydrophobicity 저하.
결국 새로운 column batch로 교체 후 정상 복귀.

교훈:
column aging은 단순히 RT drift가 아닌,
chemistry degradation의 신호일 수 있다.

10. LC gradient와 dwell volume 관리

column aging에 의한 RT shift를 정확히 해석하려면
LC gradient delay와 dwell volume을 함께 고려해야 한다.

• Gradient delay:
  mobile phase 전환이 column에 도달하기까지의 시간
• Dwell volume:
  LC system의 tubing + mixer 용적

같은 gradient 조건이라도 장비 간 dwell volume이 다르면
RT shift가 발생한다. aging으로 인해 column void가 생기면
이 효과가 더 커진다.

따라서 long-term reproducibility test에서는
system suitability sample의 RT drift를
column aging과 system variability로 분리해야 한다.

11. Column aging을 고려한 validation 설계

ICH M10 guideline에서는 bioanalytical method validation 시
“system reproducibility” 평가를 명시한다.
즉, 장비나 column의 aging이 정량 정확도에 영향을 주지 않도록
validation scope에 포함해야 한다.

실무 팁:

• validation 중간에 column 교체 → partial validation 수행
• calibration curve slope ±10% 이내 유지 여부 확인
• QC sample 3 batch 이상 cross-column 비교

이런 절차는 regulatory compliance 측면에서도 중요하다.
FDA/EMA audit 시 reproducibility failure의 주요 원인이
column drift인 경우가 상당히 많다.

12. 국내 제약사 사례

제약사Column 관리 전략특징

 

제약사	Column 관리 전략	특징
유한양행	guard column + regeneration 주기 자동화	고 throughput bioanalysis 대응
GC녹십자	column 수명 평가용 standard mix 주기적 주입	preventive maintenance 중심
대웅제약	high-matrix sample용 전용 column 분리 운용	fouling 감소, 비용 효율화

이들은 단순히 column을 “교체 부품”으로 보지 않는다.
데이터 품질을 보장하기 위한 품질 관리 대상(QC asset)으로 다루고 있다.

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13. 결론 – “Column aging을 두려워하지 말고, 예측하라”

LC-MS/MS 분석에서 column aging은 피할 수 없는 현실이다.
하지만 예측하고 관리할 수 있다면, reproducibility는 지킬 수 있다.

핵심은 다음 세 가지다.

1️⃣ column은 생체처럼 관리해야 한다 – flushing, guard, regeneration
2️⃣ 데이터 기반으로 수명 판단하라 – RT, pressure, plate number
3️⃣ batch variation을 기록하고 대비하라 – reproducibility log 필수

결국 분석 reproducibility는 장비가 아니라
column을 얼마나 잘 이해하느냐에 달려 있다.

 

 

“Column은 단순한 소모품이 아니다.
그건, 네 분석 데이터의 신뢰성을 지탱하는 심장이다.”