제약회사 연구원의 블로그

Proteomics에서 가장 중요한 단백질이 가장 먼저 보이지 않게 되는 구조Proteomics 데이터를 보다 보면 이상한 역설을 자주 경험하게 된다. 세포 기능을 실제로 조절하는 핵심 signaling protein이나 transcription factor는 잘 보이지 않는데, 상대적으로 biological novelty가 낮은 housekeeping protein은 항상 안정적으로 검출된다. 어떤 실험에서는 mitochondrial structural protein이나 ribosomal protein은 수천 개 peptide로 풍부하게 보이는데, 정작 연구자가 관심을 가지는 kinase나 regulatory protein은 missing value로 남는다.처음 proteomics를 시작한 사람들은 ..

Proteomics에서 “깨끗한 샘플”이 오히려 데이터를 왜곡할 수도 있다Proteomics workflow를 처음 배우면 sample cleanup은 거의 필수 단계처럼 등장한다. Digestion 이후 남아 있는 salt, detergent, lipid, buffer component를 제거해야 LC-MS가 안정적으로 작동하기 때문이다. 실제로 cleanup 없이 sample을 바로 주입하면 spray instability가 발생하거나 ion suppression이 심해지고, column contamination과 sensitivity 저하 문제도 빠르게 나타난다.그래서 많은 사람들은 cleanup을 “좋은 데이터”를 만들기 위한 정리 과정처럼 생각한다. 불필요한 불순물을 제거하고 peptide만 남..

Proteomics에서 가장 당연하게 믿는 과정이 사실은 가장 불안정할 수도 있다Proteomics를 처음 배우면 trypsin은 거의 절대적인 존재처럼 등장한다. 대부분의 workflow는 “단백질을 trypsin으로 digestion한 뒤 LC-MS/MS로 분석한다”는 문장으로 시작한다. 너무 익숙하다 보니 어느 순간부터는 trypsin digestion을 하나의 자동 과정처럼 받아들이게 된다. 단백질을 넣고 overnight incubation을 하면 peptide가 생성되고, 그 peptide를 기반으로 identification과 quantification이 이루어진다고 생각한다.실제로 많은 논문도 digestion 자체를 자세히 설명하지 않는다. Trypsin digestion은 이미 표준화된..

같은 단백질인데 왜 trypsin 상태 하나로 abundance가 달라질까Proteomics 데이터를 해석하다 보면 어느 순간부터 이상한 패턴이 눈에 들어오기 시작한다. 분명 biological replicate인데 특정 protein의 abundance만 유독 흔들리거나, 어떤 peptide는 consistently 낮게 검출되며, 특정 sample group에서만 fold change가 과장되어 나타나는 경우다. 처음에는 instrument variability를 의심하게 된다. LC gradient가 흔들렸나, spray stability에 문제가 있었나, ion suppression이 발생했나 같은 생각부터 하게 된다.하지만 raw peptide level 데이터를 계속 들여다보다 보면 문제는 의..

같은 샘플인데 왜 buffer 하나 바꿨을 뿐인데 결과가 달라질까Proteomics 실험을 하다 보면 어느 순간부터 이상한 경험을 반복하게 된다. 분명 같은 세포를 사용했고, 같은 장비에서 분석했으며, digestion protocol도 거의 동일한데 특정 단백질군만 유독 달라지는 경우다. 어떤 실험에서는 membrane protein이 풍부하게 검출되는데, 다른 실험에서는 cytosolic protein 위주로 결과가 쏠린다. 때로는 signaling pathway 전체가 약해지거나, 반대로 특정 stress-related protein이 과도하게 증가하는 패턴이 나타나기도 한다.처음에는 biological variability처럼 보인다. 실제 세포 상태가 달랐다고 생각하기 쉽다. 하지만 raw da..

같은 조직인데 왜 extraction protocol 하나로 proteome이 달라질까Proteomics 실험을 처음 설계할 때 많은 사람들이 가장 중요하게 생각하는 단계는 mass spectrometry 분석 조건이다. 어떤 instrument를 사용할지, DIA와 DDA 중 무엇을 선택할지, fragmentation energy는 어떻게 조정할지 같은 요소들에 관심이 집중된다. 반면 단백질 추출 단계는 상대적으로 단순한 준비 과정처럼 취급되는 경우가 많다. 조직을 lysate buffer에 넣고 깨뜨린 뒤 단백질을 녹여내는 과정 정도로 생각하기 쉽다.하지만 실제 데이터를 오래 보다 보면 생각이 달라진다. 같은 조직을 사용했는데 extraction buffer만 바뀌어도 검출되는 protein popu..

같은 샘플인데 왜 column만 바꿨는데 proteome이 달라질까Proteomics를 처음 시작할 때 LC column은 생각보다 단순한 부품처럼 보인다. 대부분의 관심은 mass spectrometer 쪽으로 향한다. Orbitrap resolution은 어느 정도인지, scan speed는 충분한지, DIA를 쓸지 DDA를 쓸지 같은 이야기들이 훨씬 중요하게 느껴진다. 반면 LC column은 그저 peptide를 분리해서 넘겨주는 소모품 정도로 취급되는 경우가 많다. 실제로 실험실에서도 column은 어느 순간부터 “원래 쓰던 것”을 계속 사용하는 영역이 된다. 누군가 예전에 잘 쓰던 제품을 반복 구매하고, 문제가 생기면 새것으로 교체하는 정도로 끝난다.그런데 데이터를 오래 보다 보면 이상한 순간..

Charge state 분포가 proteomics 해석을 바꾸는 이유Proteomics 데이터를 오래 보다 보면 이상한 순간들이 반복된다. 분명 같은 샘플이고, 같은 장비이며, gradient도 거의 동일한데 어떤 peptide는 특정 run에서만 유독 잘 보인다. 반대로 이전 run에서는 안정적으로 검출되던 peptide가 어느 날 갑자기 intensity가 급격히 감소하거나 identification에서 완전히 사라지기도 한다. 처음 이런 현상을 경험하면 대부분 장비 컨디션을 의심한다. spray가 흔들렸나, column 상태가 나빠졌나, calibration이 틀어졌나 같은 생각부터 하게 된다. 하지만 QC가 멀쩡하고 다른 peptide들은 안정적으로 검출된다면 이야기가 달라진다. 이 시점부터는 단..