제약회사 연구원의 블로그

TMT/iTRAQ에서 실제 biological difference가 점점 작아져 보이는 이유처음 TMT나 iTRAQ 데이터를 접하면 대부분 비슷한 인상을 받는다. 데이터가 굉장히 깔끔해 보인다는 점이다. Missing value도 적고, replicate consistency도 높으며, reporter ion 기반 quantification 결과가 정돈된 숫자로 떨어진다. Heatmap은 선명하고 PCA clustering도 안정적으로 나타난다.그리고 어느 순간부터 연구자는 이런 생각을 하게 된다.“이 정도면 실제 biology를 꽤 정확하게 반영하는 것 아닐까?”실제로 isobaric labeling 기반 proteomics는 label-free quantification보다 훨씬 정교한 것처럼 보인다..

Isobaric labeling proteomics에서 “정확한 정량”이라는 믿음이 흔들리는 순간Proteomics에서 iTRAQ와 TMT가 등장했을 때 많은 연구자들은 거의 혁명처럼 받아들였다. 서로 다른 sample을 하나의 mixture로 합친 뒤 동시에 LC-MS/MS 분석을 수행할 수 있고, label-free quantification에서 반복적으로 문제가 되었던 run-to-run variability도 크게 줄일 수 있었기 때문이다.특히 multiplexing capability는 enormous advantage였다. 6-plex, 10-plex, 16-plex를 넘어 최근에는 더 높은 plexing 전략까지 가능해지면서 clinical cohort와 large-scale comparat..

Proteomics에서 “숫자”는 정말 단백질 양을 의미할까Proteomics를 처음 배우는 사람들은 보통 abundance table을 보는 순간 강한 확신을 갖게 된다. Sample A에서 어떤 protein intensity가 높게 나왔고, Sample B에서는 낮게 나왔으니 해당 단백질의 실제 양이 변했다고 생각한다. 특히 modern software가 자동으로 normalization, alignment, quantification을 수행하고 fold change와 p-value까지 계산해주기 시작하면 결과는 더욱 신뢰감 있게 보인다.그리고 이 흐름의 중심에는 label-free quantification(LFQ)이 있다.최근 proteomics에서는 LFQ가 거의 표준처럼 사용된다. Stabl..

냉동 보관만 했을 뿐인데 proteomics 결과가 달라지는 이유Proteomics 실험을 하다 보면 freeze-thaw는 너무 익숙한 과정이 된다. 샘플을 수집한 뒤 바로 분석하지 못하는 경우가 대부분이기 때문에 일단 -80℃에 보관하고, 분석할 때 다시 꺼내 thawing한 뒤 사용한다. 임상 샘플은 물론이고 cell lysate, tissue homogenate, plasma, serum까지 거의 모든 proteomics workflow에서 freeze-thaw는 자연스럽게 반복된다.그래서 많은 연구자들은 freeze-thaw를 단순한 보관 과정 정도로 생각한다. 얼렸다가 녹이는 과정일 뿐이며, 단백질 자체는 대부분 안정적으로 유지될 것이라고 믿는다. 실제 논문에서도 “samples were st..

Proteomics에서 가장 위험한 신호는 biology가 아니라 preparation history일 수도 있다Proteomics 데이터를 처음 해석할 때 많은 사람들은 instrument variability를 가장 먼저 경계한다. LC gradient stability, spray fluctuation, mass accuracy drift, ion suppression 같은 요소들이 결과를 흔든다고 배운다. 실제로 이런 요소들은 매우 중요하다. 그래서 연구자들은 QC sample을 반복 주입하고, retention time alignment를 확인하며, normalization 전략을 세운다.하지만 실제 대규모 proteomics 데이터를 오래 다루다 보면 어느 순간 이상한 패턴이 보이기 시작한다...

Proteomics에서 “정제 과정”이라고 믿었던 단계가 proteome 자체를 바꿔버리는 순간Proteomics workflow에서 protein precipitation은 너무 익숙한 과정이다. Acetone precipitation, methanol/chloroform precipitation, ethanol precipitation 같은 방법은 거의 기본 protocol처럼 사용된다. Detergent를 제거하고, buffer를 교체하고, unwanted contaminant를 정리하기 위해 많은 실험실이 precipitation 단계를 routine하게 넣는다.특히 SDS 같은 강한 detergent를 사용한 뒤에는 precipitation이 거의 필수처럼 여겨진다. 그렇지 않으면 downstr..

Proteomics에서 가장 중요한 단백질이 가장 먼저 보이지 않게 되는 구조Proteomics 데이터를 보다 보면 이상한 역설을 자주 경험하게 된다. 세포 기능을 실제로 조절하는 핵심 signaling protein이나 transcription factor는 잘 보이지 않는데, 상대적으로 biological novelty가 낮은 housekeeping protein은 항상 안정적으로 검출된다. 어떤 실험에서는 mitochondrial structural protein이나 ribosomal protein은 수천 개 peptide로 풍부하게 보이는데, 정작 연구자가 관심을 가지는 kinase나 regulatory protein은 missing value로 남는다.처음 proteomics를 시작한 사람들은 ..

Proteomics에서 “깨끗한 샘플”이 오히려 데이터를 왜곡할 수도 있다Proteomics workflow를 처음 배우면 sample cleanup은 거의 필수 단계처럼 등장한다. Digestion 이후 남아 있는 salt, detergent, lipid, buffer component를 제거해야 LC-MS가 안정적으로 작동하기 때문이다. 실제로 cleanup 없이 sample을 바로 주입하면 spray instability가 발생하거나 ion suppression이 심해지고, column contamination과 sensitivity 저하 문제도 빠르게 나타난다.그래서 많은 사람들은 cleanup을 “좋은 데이터”를 만들기 위한 정리 과정처럼 생각한다. 불필요한 불순물을 제거하고 peptide만 남..