제약회사 연구원의 블로그

같은 조직인데 왜 extraction protocol 하나로 proteome이 달라질까Proteomics 실험을 처음 설계할 때 많은 사람들이 가장 중요하게 생각하는 단계는 mass spectrometry 분석 조건이다. 어떤 instrument를 사용할지, DIA와 DDA 중 무엇을 선택할지, fragmentation energy는 어떻게 조정할지 같은 요소들에 관심이 집중된다. 반면 단백질 추출 단계는 상대적으로 단순한 준비 과정처럼 취급되는 경우가 많다. 조직을 lysate buffer에 넣고 깨뜨린 뒤 단백질을 녹여내는 과정 정도로 생각하기 쉽다.하지만 실제 데이터를 오래 보다 보면 생각이 달라진다. 같은 조직을 사용했는데 extraction buffer만 바뀌어도 검출되는 protein popu..

같은 샘플인데 왜 column만 바꿨는데 proteome이 달라질까Proteomics를 처음 시작할 때 LC column은 생각보다 단순한 부품처럼 보인다. 대부분의 관심은 mass spectrometer 쪽으로 향한다. Orbitrap resolution은 어느 정도인지, scan speed는 충분한지, DIA를 쓸지 DDA를 쓸지 같은 이야기들이 훨씬 중요하게 느껴진다. 반면 LC column은 그저 peptide를 분리해서 넘겨주는 소모품 정도로 취급되는 경우가 많다. 실제로 실험실에서도 column은 어느 순간부터 “원래 쓰던 것”을 계속 사용하는 영역이 된다. 누군가 예전에 잘 쓰던 제품을 반복 구매하고, 문제가 생기면 새것으로 교체하는 정도로 끝난다.그런데 데이터를 오래 보다 보면 이상한 순간..

Charge state 분포가 proteomics 해석을 바꾸는 이유Proteomics 데이터를 오래 보다 보면 이상한 순간들이 반복된다. 분명 같은 샘플이고, 같은 장비이며, gradient도 거의 동일한데 어떤 peptide는 특정 run에서만 유독 잘 보인다. 반대로 이전 run에서는 안정적으로 검출되던 peptide가 어느 날 갑자기 intensity가 급격히 감소하거나 identification에서 완전히 사라지기도 한다. 처음 이런 현상을 경험하면 대부분 장비 컨디션을 의심한다. spray가 흔들렸나, column 상태가 나빠졌나, calibration이 틀어졌나 같은 생각부터 하게 된다. 하지만 QC가 멀쩡하고 다른 peptide들은 안정적으로 검출된다면 이야기가 달라진다. 이 시점부터는 단..

— 우리는 펩타이드를 보는 것이 아니라, 부서진 조각을 해석하고 있다proteomics 데이터를 처음 접하면대부분은 이렇게 생각한다.“MS1에서 peptide를 잡고,MS/MS에서 확인하면 되는 거 아닌가?”이 말은 틀린 건 아니다.하지만 중요한 한 단계가 빠져 있다.👉 그 peptide는 우리가 직접 보는 것이 아니라,부서진 조각을 통해 ‘추론’하는 것이라는 점이다.그리고 그 조각을 어떻게 부수느냐가바로 fragmentation 조건이다.우리는 ‘존재’를 보는 것이 아니라 ‘패턴’을 본다MS/MS에서 얻는 것은완전한 구조 정보가 아니다.b-iony-ion일부 중성 손실noise이런 조각들이 섞인 스펙트럼이다.search algorithm은이 패턴을 보고👉 “이 peptide일 가능성이 높다”라고 판..

— 우리는 세 개의 파라미터를 조정하는 것이 아니라, 하나의 ‘시간’을 나누고 있다DDA method를 세팅할 때보통은 하나씩 따로 생각한다.TopN을 몇 개로 할지AGC target을 얼마나 줄지injection time을 얼마나 줄지각각은 명확해 보인다.TopN → 몇 개를 선택할지AGC → 얼마나 많은 ion을 모을지injection time → 얼마나 오래 모을지그래서 자연스럽게 이렇게 접근한다.“TopN을 늘려서 더 많이 보고,AGC를 높여서 더 좋은 signal을 얻고,injection time도 충분히 주자”문제는이 세 가지가 동시에 성립하지 않는다는 데 있다.모든 것은 ‘cycle time’ 안에서 일어난다DDA에서 가장 중요한 자원은사실 resolution도, sensitivity도 아니..

— 더 많이 보기 위한 장치가, 오히려 덜 보게 만드는 순간처음 DDA method를 세팅할 때dynamic exclusion은 거의 당연한 옵션처럼 들어간다.설명도 단순하다.“이미 선택된 precursor를 일정 시간 동안 제외해서더 다양한 peptide를 보게 해준다”이론적으로는 완벽해 보인다.같은 것만 반복해서 분석하는 비효율을 줄이고,coverage를 넓혀준다.그래서 대부분의 경우별 고민 없이 기본값을 사용하거나조금 늘리거나 줄이는 정도로 끝난다.그런데 데이터를 몇 번 반복해서 보다 보면이 설정이 단순한 효율 문제가 아니라결과 자체를 바꾸고 있다는 느낌이 들기 시작한다.어떤 peptide는 항상 보이는데어떤 peptide는 run마다 사라지고특정 단백질은 예상보다 과소평가된다이쯤 되면 질문이 생긴..

— 더 빨리 본다는 것은 더 많이 보는 것이 아니라, 다른 것을 보게 되는 일이다처음 LC-MS 데이터를 다루다 보면scan speed는 그렇게 중요해 보이지 않는다.resolution이나 mass accuracy처럼눈에 보이는 성능 지표도 아니고,설정값도 상대적으로 단순해 보인다.그래서 많은 경우이건 그냥 기본값으로 두고 넘어간다.하지만 어느 순간부터이 변수의 존재가 드러나기 시작한다.같은 샘플인데 peptide 수가 달라지고어떤 run에서는 보이던 것이 다른 run에서는 사라지고replicate 간 변동이 설명되지 않는다이쯤 되면 자연스럽게샘플이나 장비를 의심하게 된다.하지만 조금 더 자세히 보면문제는 전혀 다른 곳에 있다.👉 얼마나 빨리 스캔했는가LC peak는 기다려주지 않는다LC-MS에서 가장..

— 우리는 다른 방식으로 측정하는 게 아니라, 다른 방식으로 ‘선택’하고 있다처음 proteomics 데이터를 접하면DDA와 DIA는 단순히 두 가지 acquisition 방식처럼 보인다.DDA는 기존 방식DIA는 더 발전된 방식그래서 자연스럽게 이렇게 생각하게 된다.“둘 다 같은 샘플을 분석하는 거니까결과는 비슷해야 하지 않을까?”하지만 실제로 데이터를 비교해보면이 기대는 쉽게 무너진다.같은 샘플인데도검출되는 단백질 수가 다르고특정 pathway는 한쪽에서만 보이고differential expression 결과까지 달라진다이건 단순한 기술적 차이가 아니다.👉 데이터를 만들어내는 방식 자체가 다르기 때문이다출발점부터 다르다: “무엇을 볼 것인가”DDA와 DIA의 가장 큰 차이는측정 방식이 아니라👉 무..