Proteomics + Metabolomics 통합 분석을 통한 약물 독성 메커니즘 규명

– “단일 오믹스로는 절대 보이지 않는 신호들”

Proteomics + Metabolomics 통합 분석을 통한 약물 독성 메커니즘 규명

1. 서론 – “독성은 한 지점에서 발현되지만, 원인은 네트워크 전체에서 시작된다”

신약 개발 과정에서 가장 치명적인 리스크는 결국 “독성”이다.
in vitro에서는 아무 문제 없던 화합물이 in vivo에서 갑자기 간독성을 보이고,
임상에서는 환자 일부에서 예측 불가능한 부작용이 터진다.

전통적인 방식은 특정 biomarker를 모니터링하거나
PK profile에서 노출도(exposure)를 확인하는 수준이었다.
하지만 독성이란 게 그렇게 단순하지 않다.

독성은 대개 대사 경로의 무너짐(metabolic collapse)과
단백체 수준에서의 기능적 붕괴(proteome disruption)가 복합적으로 일어나면서 나타난다.

그래서 등장하는 접근이 바로 Proteomics + Metabolomics ‘통합 분석’(multi-omics integration)이다.

한 가지 layer만 보면 절대 보이지 않는 신호들이,
다층 분석에서는 정확한 형태로 드러난다.

이 글에서는 LC-MS/MS 기반 targeted metabolomics + DIA proteomics 조합을 중심으로,
약물 독성 메커니즘을 파헤치는 실제 R&D 분석 전략을 깊게 다뤄본다.

2. 왜 통합 오믹스인가? — “단백질은 원인이고, 대사체는 결과다”

Drug-induced toxicity를 설명할 때,
대사체만 보면 결과는 보이지만 원인은 보이지 않는다.
반대로 proteomics만 보면 pathway activation은 보이지만,
실제 phenotype(대사 변화)이 연결되지 않는다.

두 레이어에는 명확한 역할 분리가 존재한다.

Proteome

• 효소 발현
• 단백질 abundance 변화
• pathway activation/inactivation
• stress response signaling

Metabolome

• 실제 대사 flux의 결과
• pathway 최종 산물
• 에너지 imbalance
• 독성의 “즉각적 지표”

즉, proteomics는 시스템의 명령,
metabolomics는 그 명령의 실행 결과를 보여준다.

이 두 가지를 함께 분석해야만
“독성의 원인 → 독성의 표현” 사이의 causal chain이 보인다.

3. Multi-omics 워크플로 개요

실험 기반 team에서 실제로 구축할 수 있는 통합 플랫폼은 다음 구조다.

 

[In vivo 또는 In vitro 독성 모델]

↓

Sample prep (plasma/tissue)

↓

Proteomics (DIA/SWATH)

↓

Metabolomics (LC-MS/MS)

↓

데이터 정규화 / batch correction

↓

연계 분석 (CCA, WGCNA, MOFA, DIABLO)

↓

Toxicity mechanism 모델링

 

각 단계마다 주의해야 하는 QC 기준, normalization 방식, drift 보정 방법 등을 이후에 자세히 설명한다.

 

4. Sample preparation – 두 플랫폼이 “같은 생물학적 맥락”을 반영해야 한다

Proteomics와 Metabolomics는 같은 시료에서 준비하는 것이 가장 이상적이다.
특히 liver homogenate나 hepatocyte lysate는 drug-induced liver injury(DILI) 분석에서 가장 많이 사용된다.

추천 워크플로:

1. Tissue homogenization → aliquot 분리
2. Proteomics: protein extraction → trypsin digestion → DIA LC-MS
3. Metabolomics: methanol crash → supernatant → HILIC/RP LC-MS/MS

중요한 점은,
sample split timing을 최대한 초기에 가져가야 한다는 것이다.

Proteome은 안정적인 편이지만,
metabolite는 순간적으로 변하거나 degradation이 빠르다.
따라서 snap-freeze → aliquot → parallel prep이 필수다.

5. Proteomics 분석 – DIA 기반 네트워크 수준 독성 신호 포착

과거에는 DDA 기반으로 ID 의존적 분석을 했지만,
요즘 약물 독성 연구에서 가장 많이 쓰이는 포맷은 DIA (data-independent acquisition)이다.

장점:

• 재현성 높음
• missing value 적음
• global protein profile 안정적
• pathway-level 분석 용이

독성 연구에서 중요하게 보는 protein signatures:

1️⃣ Mitochondrial dysfunction

• Complex I/II subunit 감소
• ATP5F1, NDUFA 계열 감소

2️⃣ ER stress / UPR

• BiP(HSPA5), ATF4, CHOP 증가

3️⃣ Inflammation

• NF-κB pathway protein 증가

4️⃣ Oxidative stress

• SOD1/2, PRDX family 변화

5️⃣ Detoxification pathway

• CYP450 isoform 발현 변화
• Glutathione-S-transferase (GST) 변화

단백체 수준에서 일단 “망가지기 시작한 시스템”을 확인하는 것이
첫 번째 layer다.

 

6. Metabolomics 분석 – 독성의 ‘현장’에서 나타나는 결과값

Metabolome은 phenotypic outcome을 반영하는 최전선 데이터다.

독성 상황에서 변하는 대표적인 metabolite signatures:

1) TCA cycle collapse

• citrate ↓
• succinate ↑
• malate ↓

2) Oxidative stress

• GSH ↓
• cysteine ↓
• cysteine-glutathione disulfide ↑

3) Lipid remodeling

• phosphatidylcholine species 변화
• acylcarnitine accumulation

4) Energy depletion

• AMP ↑
• ATP/AMP ratio 감소

이런 신호들은 모두 LC-MS/MS 기반 targeted metabolomics로 매우 정밀하게 측정 가능하다.

7. 통합 분석이 필요한 이유 – 단일 오믹스가 숨기는 3가지

(1) proteomics만 보면 보이지 않는 대사 flux 변화

예를 들어, TCA cycle enzyme은 정상으로 보이지만,
metabolome은 succinate가 비정상적으로 쌓일 수 있다.
→ 이건 TCA enzyme 발현 문제가 아니라
mitochondrial electron transport chain 기능 부전으로 인한 back-pressure다.

(2) metabolomics만 보면 보이지 않는 upstream trigger

Metabolite가 변했다고 해서
그게 어디에서 시작된 변화인지 알 수 없다.
엔진에 문제가 생긴 건지, 연료 공급에 문제가 생긴 건지 분간이 어렵다.

(3) 독성의 원인·경과·결과를 시간축으로 볼 수 없다

Proteome은 slowly changing signal,
Metabolome은 fast response signal.

두 개를 함께 보면
독성 진행을 “시간 순서”로 해석할 수 있게 된다.

8. 실제 DILI 모델 예시 – APAP(아세트아미노펜) 독성

APAP는 multi-omics 연구에서 가장 자주 등장하는 DILI 모델이다.

Proteomics 결과:

• CYP2E1 증가 → NAPQI 생성 증가
• UPR protein (ATF4/CHOP) 증가
• mitochondrial complex I subunit 감소

Metabolomics 결과:

• GSH 급격한 감소
• glutathione disulfide 증가
• citrate ↓ succinate ↑ → mitochondrial dysfunction
• acylcarnitine accumulation (fatty acid oxidation 탈선)

통합 해석:

1. CYP2E1 증가 → NAPQI 생성
2. GSH depletion → ROS 증가
3. ROS 증가 → 미토콘드리아 complex 손상
4. TCA cycle 붕괴 → 에너지 고갈
5. hepatocyte necrosis 발생

이건 단일 omics로는 절대 완성되지 않는 기전도식이다.

9. Multi-omics 연계 분석 방법론

여기서부터는 분석자 입장에서 가장 고민이 많은 단계다.

1) Correlation network

• metabolite ↔ protein correlation matrix
• e.g., succinate ↔ NDUFA9 (negative correlation)

2) WGCNA (Weighted Gene Co-expression Network Analysis)

• 단백체 모듈과 대사체 모듈을 연결
• toxicity phenotype과 연계

3) CCA (Canonical Correlation Analysis)

• proteome-metabolome pair를 canonical variate로 정리

4) DIABLO (mixOmics)

• multi-block integration
• 독성 그룹 분리를 최적화하는 연계 feature 선정

실제 제약사 연구에서는 DIABLO와 CCA를 가장 많이 사용한다.

10. Case Study – “독성 후보물질 X의 간독성 메커니즘 규명”

(가상 시나리오이지만 실제 연구와 매우 유사한 형태로 구성)

Observed toxicity:

• ALT/AST 상승
• 몇 동물에서 국소적 necrosis

Proteomics 결과:

• ATP synthase subunit 5개 감소
• ER-stress marker 증가
• CYP1A2 증가

Metabolomics 결과:

• ATP/AMP ratio 감소
• succinate ↑
• palmitoylcarnitine ↑
• bile acid buildup

통합 해석:

1. mitochondrial ATP synthase 감소 → ATP 생산 저하
2. succinate 증가 → ETC block
3. bile acid 증가 → BSEP inhibition (cholestasis)
4. palmitoylcarnitine 증가 → fatty acid oxidation 실패

결론:
이 후보물질은 ETC complex 효율 저하 + bile acid clearance 장애를 동시에 일으키는 기전으로 간독성을 유발한다.

11. LC-MS/MS 관점에서의 실무 포인트

Proteomics + Metabolomics 통합 분석에서 가장 중요한 건
각 플랫폼의 재현성(reproducibility) 확보다.

Proteomics QC 포인트

• iRT QC peptide clustering
• DIA library QC
• Qvalue < 1%

Metabolomics QC 포인트

• pooled QC CV < 20%
• internal standard response drift correction
• retention time shift < ±0.2 min

두 데이터의 신뢰성 없이는
아무리 fancy한 multi-omics 통계 기법도 의미가 없다.

12. 국내 제약사 적용 가능성

현재 국내에서 multi-omics를 적극적으로 도입하는 회사는 많지 않지만,
패러다임은 이미 넘어가고 있다.

• GC녹십자: 간독성 후보물질 다층 오믹스 파일럿
• 삼성바이오로직스: 대사체-단백체 기반 cell line 특성 평가

특히 “실험 기반 분석팀”이 LC-MS/MS 인프라를 갖추고 있다면,
통합 오믹스는 더 이상 먼 기술이 아니다.
데이터 처리 layer만 확장하면 된다.

13. 결론 – “독성은 무작위가 아니다. 패턴이다.”

Proteomics는 독성의 시작을 보여주고,
Metabolomics는 독성의 끝을 보여준다.

두 가지를 통합하면
“독성이 언제 시작되고 어떻게 진행되는지”가 시간축으로 보인다.

 

단일 오믹스로는 독성의 그림을 볼 수 없고,
통합 오믹스에서는 독성의 ‘이유’를 볼 수 있다.