Stable Isotope-Labeled Internal Standard(SIL-IS) 최적화 전략

동위원소 표지 내부표준 선택, Matrix Effect 최소화, Long-term Stability 확보

Stable Isotope-Labeled Internal Standard(SIL-IS) 최적화 전략

1. 서론 – 왜 SIL-IS가 중요한가?

LC-MS/MS는 지난 20년간 의약품 분석, 대사체학, 임상 진단 분야에서 “골드 스탠다드” 기술로 자리잡았습니다.
그러나 이 기술의 가장 큰 단점 중 하나는 매트릭스 효과(matrix effect)와 시료 전처리 과정에서 발생하는 손실입니다.

예를 들어, 혈장 내 저농도 약물을 정량할 때, 단순한 protein precipitation만으로는 ion suppression을 완전히 피하기 어렵습니다. 또, 장비 drift나 이온 소스 오염 때문에 장기적인 reproducibility도 흔들릴 수 있습니다.

이러한 불확실성을 해결하기 위한 가장 강력한 도구가 바로 Stable Isotope-Labeled Internal Standard(SIL-IS)입니다.

• Analyte와 동일한 구조 → 전처리 손실 보정
• 동일한 이온화 효율 → matrix effect 상쇄
• 동시 주입/검출 → 장비 drift 보정

즉, SIL-IS는 LC-MS/MS 분석에서 “결과 신뢰도를 지탱하는 안전장치”라고 할 수 있습니다.

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2. 동위원소 표지 내부표준 선택 시 고려사항

많은 연구자가 단순히 "Analyte-d3" 같은 동위원소 표지체를 구매해 사용하지만, 실제로는 어떤 동위원소를 선택했는가가 분석 성능에 큰 차이를 만듭니다.

2.1 구조적 동일성

• 가장 이상적인 IS = Analyte와 동일한 구조 + 동위원소 치환
• 예: Tacrolimus → Tacrolimus-¹³C,¹⁵N
• 만약 구조적 차이가 크면 전처리 효율, 분리 조건, 이온화 특성이 달라지므로 보정력이 급격히 떨어집니다.

2.2 동위원소 치환 위치

• Deuterium(²H)은 상대적으로 값이 싸지만, 산성 조건에서 수소-중수소 교환이 일어날 수 있어 장기 분석에서는 불리합니다.
• ¹³C, ¹⁵N, ¹⁸O 치환은 화학적 안정성이 높아 FDA/EMA 가이드라인에서도 더 권장됩니다.

2.3 질량 분리도 확보

• 일반적으로 Analyte와 ≥3 Da 이상의 차이가 있어야 mass overlap 문제가 줄어듭니다.
• HRMS에서는 isotopic cluster가 겹칠 가능성이 있어 Δm/z ≥ 5 Da 이상 확보가 권장됩니다.

2.4 이온화 거동

• ESI 소스에서 suppression이 발생할 때, Analyte와 동일한 suppression을 받는 것이 중요합니다.
• 즉, 구조적 유사성 + 이온화 거동 일치가 확보되어야 진정한 내부표준이 됩니다.

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3. Matrix Effect 최소화 전략

Matrix effect는 LC-MS/MS에서 가장 빈번하고 치명적인 오차 요인입니다.
혈장 단백질, 인지질, 소변 내 염류, 담즙산 등은 모두 이온화 효율을 방해할 수 있습니다.

3.1 SIL-IS 농도 설정

• 너무 낮으면 잡음(noise)에 묻혀 보정력이 떨어지고,
• 너무 높으면 오히려 analyte와 ionization competition 발생.
• 일반적으로 analyte 농도 범위의 중간값 근처에 맞추는 것이 이상적입니다.

3.2 Multi-SIL-IS 적용

• 스테로이드 패널, 비타민 대사체 패널처럼 다중 analyte 분석에서는 각각 SIL-IS를 쓰는 것이 가장 이상적.
• 비용 문제 때문에 surrogate IS를 사용하는 경우가 많지만, 이 경우 validation에서 반드시 matrix effect 보정률을 비교해야 합니다.

3.3 매트릭스별 검증

• 혈장, 전혈, DBS, 소변, CSF 등 매트릭스가 달라지면 matrix effect 패턴도 크게 달라집니다.
• 따라서 매트릭스별 validation에서 SIL-IS 효과를 재검증해야 합니다.

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📊 [표 1] Deuterated vs ¹³C-labeled SIL-IS 비교

 

구분	Deuterated (d3, d6등)	¹³C/¹⁵N-labeled
비용	상대적으로 저렴	더 비쌈
안정성	H/D 교환 가능 → long-term 불안정	화학적으로 안정
Mass shift	보통 +3~+6 Da	자유롭게 설계 가능
Matrix effect 보정력	경우에 따라 불완전	거의 완전 일치
규제기관 선호도	제한적 허용	강력히 권장

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4. Long-term Stability 확보 전략

임상시험이나 TDM 연구에서는 수천 개 시료를 몇 달~몇 년에 걸쳐 분석합니다.
따라서 SIL-IS 자체의 안정성 관리가 굉장히 중요합니다.

4.1 Stock Solution 안정성

• 용매: ACN/MeOH 혼합 + 소량의 포름산(0.1%) 첨가 시 안정성 증가
• 온도: -20℃ 이하 장기 보관, working solution은 -80℃ aliquot 권장
• 빛 차단: 비타민 D, 스테로이드 등은 광분해 방지 필요

4.2 Freeze-thaw Cycle Test

• SIL-IS도 analyte와 동일하게 ≥3회 이상 freeze-thaw test 필요
• CLSI EP25-A guideline 참고

4.3 QC Sample 모니터링

• 장기 프로젝트에서는 SIL-IS를 포함한 QC sample을 batch마다 함께 분석
• IS/Analyte 비율이 drift하는지 주기적으로 체크 → 장비 이상·시약 분해 조기 감지

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5. 실제 적용 사례

5.1 Tacrolimus TDM

• 초기에 Tacrolimus-d2 사용 → hydrogen exchange 문제 발생
• Tacrolimus-¹³C,¹⁵N SIL-IS로 교체 → long-term reproducibility 개선, FDA validation 통과

5.2 Vitamin D 대사체 분석

• 25(OH)D3-d6 사용 시 matrix effect 완전 보정 불가
• ¹³C-labeled 25(OH)D3 적용 → CE-IVD 인증 시 reproducibility 지표 개선

5.3 Steroid 패널 분석

• 10종 이상 스테로이드 동시 정량 시, 개별 SIL-IS 비용 부담 큼
• 구조 유사성 기반 surrogate SIL-IS 적용 → validation에서 일부 성분 보정 한계 확인
• 이후 규제기관 제출용 분석에서는 개별 SIL-IS 사용으로 변경

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📊 [표 2] 실제 사례에서 SIL-IS 적용 효과

 

Analyte	SIL-IS 종류	Matrix Effect 보정률	Long-term CV%
Tacrolimus	d2	~70%	12%
Tacrolimus	¹³C,¹⁵N	>95%	6%
25(OH)D3	d6	~80%	10%
25(OH)D3	¹³C-labeled	>98%	4%
Cortisol 패널	surrogate IS	~85%	11%
Cortisol-d4	개별 SIL-IS	>97%	5%

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6. 규제 관점에서의 SIL-IS

• FDA Bioanalytical Method Validation Guidance (2018): IS는 가능한 한 analyte와 구조적 유사성이 높은 stable isotope-labeled compound를 사용할 것을 권장.
• EMA Guideline (2011): surrogate IS 사용 시 반드시 충분한 검증 데이터 제출 요구.
• IVD 인증 (CE-IVD, ISO 13485): reproducibility와 batch-to-batch consistency 보장을 위해 개별 SIL-IS 사용을 강력 권장.

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7. 결론

SIL-IS는 LC-MS/MS 정량 분석의 정확도를 떠받치는 “보이지 않는 안전망”입니다.
그러나 단순히 "동위원소가 붙었다"는 이유만으로 무조건 신뢰할 수 있는 것은 아닙니다.

• 동위원소 종류와 치환 위치 선택
• 질량 분리도 확보
• 매트릭스별 효과 검증
• 장기 안정성 관리
• 규제 기관 가이드라인 충족

이 모든 요소를 종합적으로 고려해야, 연구실 수준을 넘어 임상시험·IVD 인증 단계에서도 인정받을 수 있는 분석법을 만들 수 있습니다.

궁극적으로, SIL-IS 최적화는 단순히 “실험을 잘 하기 위한 기술”을 넘어,
신약 개발, 환자 맞춤형 치료(TDM), 바이오마커 발굴 등 미래 정밀의학의 토대를 다지는 전략이라고 할 수 있습니다