Cryo-preservation 조건이 LC-MS/MS 분석 결과에 미치는 영향

Liquid nitrogen snap-freezing vs controlled-rate freezing, 그리고 장기 보관에서의 대사체 degradation 패턴 비교

Cryo-preservation 조건이 LC-MS/MS 분석 결과에 미치는 영향

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서론: Cryo-preservation과 약물·대사체 분석의 접점

바이오의약품 개발이나 대사체학(metabolomics) 연구, 약물동태학(PK) 분석에서 시료의 integrity(보존성)는 분석 정확도에 직접적인 영향을 미친다. 특히 혈장, 혈청, 조직 homogenate, 세포 추출물 등은 생체 효소나 산화 반응에 의해 대사체가 빠르게 변형될 수 있다. 예를 들어, ATP는 수 분 내에 ADP/AMP로 분해될 수 있고, 지방산은 산화 반응에 의해 peroxidation artifact를 생성할 수 있다. 따라서 시료 채취 직후의 보존 방법(cryo-preservation condition)은 LC-MS/MS 기반 정량 분석에서 가장 중요한 변수 중 하나다.

Cryo-preservation은 크게 두 가지 전략으로 나뉜다.

1. Liquid nitrogen snap-freezing (액체질소 급속 냉동) – 수 초 내로 -196℃까지 시료를 냉각하여 모든 효소 활성을 순간적으로 억제.
2. Controlled-rate freezing (서서히 냉각, -1℃/min 등) – 세포/조직의 손상을 최소화하기 위해 사용되며, 특히 세포/조직 보관에서 자주 적용.

두 방식은 모두 장단점이 존재하며, 장기 보관에서 대사체 degradation 패턴에 서로 다른 영향을 미친다. 본 글에서는 두 freezing 전략을 LC-MS/MS 분석 관점에서 비교하고, 대사체 안정성, matrix effect, 분석 reproducibility 측면에서 구체적으로 다루어 보겠다.

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1. Cryo-preservation의 기본 원리와 분석 시 고려 요소

1.1. Snap-freezing (Liquid nitrogen)

• 원리: 시료를 액체질소(-196℃)에 즉시 침지하여 초단시간 내에 급격히 냉각.
• 장점: 효소 활성 억제가 거의 즉시 발생 → 대사체 안정성 보존 최적화.
• 한계: 조직/세포 내부에 ice crystal 형성이 불균일하게 일어나, 세포 구조 손상이 발생할 수 있음.
• 분석적 영향: cell rupture가 과도하게 일어나면 matrix complexity 증가 → ion suppression 가능성 존재.

1.2. Controlled-rate freezing

• 원리: -1℃/min 속도로 서서히 냉각 → 세포 내부와 외부의 삼투압 균형을 맞추며 얼음 형성.
• 장점: 세포 viability 유지에 최적화. 세포/조직 은행에서 자주 활용.
• 한계: 냉각 중 효소 반응이 수분~수십 분간 지속될 수 있어, 대사체 degradation 발생 가능.
• 분석적 영향: ATP → ADP/AMP 분해, glutathione oxidation, acylcarnitine 감소 등 false-negative artifact가 보고됨.

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2. LC-MS/MS 분석 관점에서 본 freezing 방법 비교

2.1. Polar metabolite stability (ATP, NADH, amino acids)

• Snap-freezing: ATP/ADP ratio가 in vivo 상태와 거의 동일하게 보존됨.
• Controlled-rate freezing: glycolysis가 계속 진행되어 lactate 상승, ATP 감소.
• LC-MS/MS quantitation 시 → ATP/ADP ratio 지표가 실제 생리 상태보다 낮게 측정되는 artifact 발생.

2.2. Lipidomics 관점

• Snap-freezing: lipid oxidation 최소화. 단, freeze–thaw 반복 시 polyunsaturated fatty acid degradation 빠르게 진행.
• Controlled-rate freezing: ROS(reactive oxygen species)에 의한 lipid peroxidation artifact 증가.
• LC-MS/MS에서 MRM transition 모니터링 시 → unexpected oxidized species (m/z shift +16, +32) 검출됨.

2.3. Small molecule xenobiotics (약물, 대사산물)

• Snap-freezing: 약물 농도 변화 거의 없음.
• Controlled-rate freezing: esterase, amidase 활성 지속으로 prodrug degradation 가능. 예: oseltamivir → oseltamivir carboxylate 비율 변화.
• 결과적으로 PK profile 왜곡 발생.

 

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3. 장기 보관에서의 degradation 패턴

Cryo-preservation은 단기 안정성뿐 아니라, 6개월~5년 장기 보관 시 시료 integrity에 중요한 역할을 한다.

3.1. Proteolysis & peptide stability

• Snap-freezing + -80℃ 보관: peptide degradation 억제.
• Controlled-rate freezing 후 -80℃ 보관: protease 활성으로 fragment peptide 증가.
• LC-MS/MS quantitation 시 multiple fragment peaks 발생 → peak integration error 발생 가능.

3.2. Organic acids & SCFAs

• Acetate, propionate 등 SCFA는 비교적 안정적.
• Lactate/pyruvate ratio는 controlled-rate freezing에서 artifact 발생.
• 장기 보관 시 pyruvate 감소, lactate 증가 → energy metabolism biomarker 연구에 혼란 초래.

3.3. Endogenous antioxidant (glutathione)

• Snap-freezing: reduced GSH/GSSG ratio 안정적으로 유지.
• Controlled-rate freezing: GSH oxidation 진행 → GSSG ratio 증가.
• Redox biomarker 연구에서 false oxidative stress signal 발생.

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4. Freeze-thaw cycle의 영향

Freezing 조건과 더불어 freeze-thaw 반복 횟수도 LC-MS/MS 결과에 결정적 영향을 미친다.

• Snap-freezing sample: 3~5 cycle까지도 상대적으로 안정적.
• Controlled-rate freezing sample: 1~2 cycle만 거쳐도 significant degradation 발생.
• 특히 phospholipid, acylcarnitine class에서 fragmentation artifact 급증.

 

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5. 대사체 안정성 보존을 위한 practical 전략

Cryo-preservation의 한계는 완전히 극복할 수 없지만, 몇 가지 보조 전략을 병행하면 LC-MS/MS reproducibility를 크게 향상시킬 수 있다.

1. Stabilizer 첨가
   • glycolysis inhibitor (NaF, iodoacetate)
   • antioxidant (BHT, ascorbate)
   • protease inhibitor cocktail
2. Aliquoting
   • freeze-thaw 반복 최소화를 위해 소분 저장.
3. Storage temperature
   • -80℃ vs liquid nitrogen vapor phase (-150℃).
   • 일부 대사체(특히 labile peptide)는 -80℃에서 수개월 내 degradation.
4. Tube material 선택
   • polypropylene vs low-binding tube 비교.
   • 특정 metabolite의 adsorption artifact 방지.

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6. 실제 연구/임상 적용 사례

6.1. Rat serum metabolomics (Energy metabolism biomarkers)

• Snap-frozen group: lactate/pyruvate ratio stable.
• Controlled-rate freezing group: lactate 30% 증가, pyruvate 20% 감소 (LC-MS/MS quant).

6.2. Monkey liver homogenate (Drug metabolism study)

• Oseltamivir stability test:
  • Snap-frozen: 95% parent compound 유지 (1개월 보관).
  • Controlled-rate freezing: 60% 유지, 40% hydrolysis artifact 검출.

6.3. Human plasma lipidomics

• Snap-freezing sample: oxidized phosphatidylcholine species <5% 검출.
• Controlled-rate freezing sample: oxidized species 비율 20~25%.

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7. 향후 표준화 과제

Cryo-preservation 조건은 연구실마다 차이가 크며, 대사체 분석의 reproducibility를 저해하는 주요 요인이다. 따라서 다음과 같은 국제 표준화가 필요하다.

• Metabolomics Society & ICH guideline 제정
• Sample integrity QC marker 도입 (예: ATP/ADP ratio, GSH/GSSG ratio)
• Freezing method metadata 공유 (저장 조건을 논문/데이터베이스에 명시)
• Cross-lab harmonization – 동일한 cryo-protocol을 적용한 multi-center study 수행

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결론

Cryo-preservation 조건은 LC-MS/MS 기반 약물·대사체 분석에서 데이터 신뢰도와 reproducibility의 핵심 변수이다.

• Snap-freezing은 대사체 안정성 보존에 가장 유리하지만, 구조적 손상 및 matrix effect 가능성 존재.
• Controlled-rate freezing은 세포 viability에는 유리하나, 대사체 분석에는 artifact 위험이 크다.
• 장기 보관에서는 degradation 패턴이 metabolite class별로 상이하므로, 연구 목적에 맞는 freezing strategy가 필요하다.

궁극적으로, metabolomics와 약물 분석 분야에서는 sample preparation 단계에서의 cryo-preservation 조건 표준화가, 신뢰성 있는 PK/PD 연구 및 바이오마커 발굴을 가능하게 하는 열쇠라 할 수 있다.