LC-MS/MS 기반 Metabolite Profiling에서 Extraction Recovery 확보 전략

 정량 신뢰도의 시작점은 회수율이다

 

LC-MS/MS 기반 Metabolite Profiling에서 Extraction Recovery 확보 전략

LC-MS/MS 기반 metabolite profiling에서 extraction recovery는 단순한 전처리 성능 지표가 아니다. 회수율은 정량 정확도, 재현성, 매트릭스 효과 해석, 생물학적 변동성 구분에 직접적으로 영향을 미치며, 특히 다수 대사체를 동시에 다루는 targeted/untargeted profiling 환경에서는 분석 결과의 신뢰도를 좌우하는 핵심 요인이다.

본 문서는 bioanalytical 실무 관점에서 왜 회수율이 흔들리는지, 그리고 어떻게 하면 metabolite profiling 목적에 부합하는 회수율을 안정적으로 확보할 수 있는지를 단계별로 정리한다. 단일 화합물 정량법이 아닌, 다성분·다극성·다농도 범위를 전제로 한 전략에 초점을 둔다.

1. Metabolite Profiling에서 Extraction Recovery의 의미 재정의

1.1 ‘높은 회수율’보다 중요한 것

일반적인 bioanalysis에서는 회수율이 높을수록 좋다고 여겨진다. 그러나 metabolite profiling에서는 절대 회수율보다 상대적 일관성이 더 중요하다.

• 95% 회수율이지만 batch 간 편차가 큰 경우
• 60% 회수율이지만 matrix·time·operator에 대해 안정적인 경우

후자가 profiling과 통계 해석에는 훨씬 유리하다. 특히 PBPK 연동, biomarker 탐색, disease progression 분석에서는 일관된 bias가 예측 가능성을 만든다.

1.2 Recovery와 Matrix Effect의 분리 인식

실무에서 흔히 발생하는 오류는 recovery 저하를 matrix effect로 오인하는 것이다. 두 개념은 전혀 다르다.

• Recovery: 전처리 과정에서 분석물이 얼마나 회수되었는가
• Matrix effect: 이온화 단계에서 신호가 얼마나 억제/증강되었는가

Recovery가 불안정하면 matrix effect 평가 자체가 왜곡된다. 따라서 metabolite profiling에서는 recovery → matrix effect → ionization efficiency의 순서로 문제를 분해해야 한다.

2. 대사체 특성별 Recovery 저하 메커니즘

2.1 극성 대사체 (Amino acids, SCFAs, nucleotides)

극성 대사체는 전처리 과정에서 가장 빈번하게 손실된다.

• 단백 침전 시 상층액에 남지 않고 pellet에 공침
• SPE loading 단계에서 breakthrough 발생
• 용매 증발 과정에서揮散 또는 분해

전략 포인트

• PPT 시 유기용매 비율을 무조건 높이지 말 것
• SCFA의 경우 derivatization 전 회수율 평가 필수
• nucleotide 계열은 pH 의존적 안정성 확인

2.2 중간 극성 대사체 (Bile acids, steroids)

이 군은 SPE 선택에 따라 회수율이 급변한다.

• reversed-phase SPE: retention 불안정
• mixed-mode SPE: 조건 최적화 실패 시 손실

전략 포인트

• pKa 기반 ionization state 계산 후 SPE 선택
• wash solvent의 유기용매 농도 5% 차이도 회수율에 영향

2.3 비극성 대사체 (lipids, eicosanoids)

비극성 대사체는 회수율 자체는 높지만 선택적 손실이 문제다.

• 특정 subclass만 회수
• 산화/분해로 인한 apparent recovery 감소

전략 포인트

• 항산화제(BHT 등) 사용 검토
• glass vs plastic adsorption 비교

3. Sample Preparation 전략별 Recovery 특성

3.1 Protein Precipitation (PPT)

장점

• 빠르고 재현성 높음
• high-throughput 적합

한계

• 극성 대사체 손실
• 단백 결합 대사체 왜곡

개선 전략

• MeOH/ACN 혼합 비율 최적화
• salt addition으로 극성 대사체 회수 개선
• pellet 재추출 검토

3.2 Solid Phase Extraction (SPE)

장점

• matrix 제거 효과 우수
• 선택적 농축 가능

한계

• 조건 민감도 높음
• lot-to-lot variability

개선 전략

• loading pH scouting 필수
• wash 단계에서 step gradient 적용
• recovery mapping (metabolite class별)

3.3 Liquid-Liquid Extraction (LLE)

장점

• 비극성 대사체 회수율 우수

한계

• 극성 대사체 적용 불가
• emulsion 문제

개선 전략

• salt-out 조건 최적화
• solvent density 차이 활용

4. Internal Standard(IS) 설계와 Recovery 해석

4.1 IS 추가 시점의 중요성

• Pre-extraction IS: 전체 recovery + matrix effect 보정
• Post-extraction IS: ionization 보정만 가능

Metabolite profiling에서는 반드시 pre-extraction IS가 필요하다.

4.2 Class-based IS 전략

모든 대사체에 isotope IS를 쓰는 것은 비현실적이다.

• amino acid mix IS
• lipid class 대표 IS
• bile acid surrogate IS

→ class-level recovery correction이 실무적 대안이다.

5. Recovery 평가 설계: 실무에서 놓치기 쉬운 포인트

5.1 Spiking level 선택

• LLOQ 부근만 평가 → 실제 profiling 왜곡
• 반드시 low–mid–high 전 농도 구간 평가

5.2 Matrix 다양성 반영

• pooled matrix만 사용 시 개인차 반영 불가
• 최소 6 lot 이상 평가 권장

5.3 Stability와 Recovery의 분리

• freeze–thaw 중 손실을 recovery 저하로 오인하지 말 것

6. Untargeted Metabolomics에서 Recovery 접근법

Untargeted 환경에서는 모든 대사체의 recovery를 정의할 수 없다.

실무 전략

• feature 수 유지율 비교
• TIC/median intensity 기반 평가
• QC sample drift와 연계 분석

Recovery는 절대값이 아니라 시스템 안정성 지표로 활용한다.

7. Recovery 저하의 흔한 원인과 디버깅 로드맵

1. 특정 class만 저하 → SPE/wash 조건 점검
2. 개인별 변동 큼 → matrix effect 분리 평가
3. batch 간 차이 → solvent lot, cartridge lot 확인
4. ISR 실패 동반 → adsorption 또는 stability 의심

8. Regulatory 관점에서의 Recovery 설명 전략

규제기관은 완벽한 회수율보다 논리적 설명을 요구한다.

• 왜 이 회수율이 허용 가능한가?
• biological interpretation에 어떤 영향이 있는가?
• bias는 어느 방향인가?

Recovery 데이터는 validation table이 아니라 과학적 서사의 일부가 되어야 한다.

9. 실무 체크리스트

• 대사체 class별 recovery map 구축
• pre-extraction IS 적용 여부 확인
• matrix lot 간 recovery 비교
• stability 영향 분리 평가
• profiling 목적에 맞는 허용 기준 설정

결론

LC-MS/MS 기반 metabolite profiling에서 extraction recovery는 단순한 숫자가 아니다. 그것은 분석 시스템이 생물학적 현실을 얼마나 왜곡 없이 전달하고 있는가를 보여주는 지표다.

높은 회수율을 쫓기보다, 예측 가능하고 설명 가능한 회수율을 만드는 것. 그것이 profiling 데이터가 통계와 모델, 그리고 의사결정으로 연결되는 유일한 길이다.