Protein Precipitation vs. SPE vs. LLE 분석 목적에 따른 선택 기준

 “전처리는 기술이 아니라 전략이다”

Protein Precipitation vs. SPE vs. LLE 분석 목적에 따른 선택 기준

LC-MS/MS 기반 bioanalysis에서
sample preparation은 흔히 이렇게 취급된다.

“이미 정해진 루틴”
“분석 전에 그냥 거치는 단계”
“LC-MS 조건이 더 중요하다”

그러나 실제 프로젝트 경험이 쌓일수록
분석팀은 한 가지 사실을 뼈저리게 느낀다.

문제가 생기는 지점의 70% 이상은
LC나 MS가 아니라 sample preparation이다.

Protein precipitation(PPT),
Solid-phase extraction(SPE),
Liquid–liquid extraction(LLE).

이 세 가지 전처리 기법은
교과서적으로는 장단점이 명확해 보이지만,
실제 현장에서는 분석 목적에 따라 평가 기준이 완전히 달라진다.

이 글에서는
“어떤 전처리가 가장 좋은가?”가 아니라,

“지금 이 분석 목적에
어떤 전처리가 가장 덜 위험한가?”

라는 질문에 답해보고자 한다.

1. 전처리 선택의 출발점: 분석 목적 정의

전처리를 선택하기 전에
분석팀이 반드시 스스로에게 물어야 할 질문은 이것이다.

이 분석은 무엇을 위해 존재하는가?

같은 LC-MS/MS 분석이라도
목적에 따라 전처리의 최적 해답은 완전히 달라진다.

1.1 분석 목적별 전처리 우선순위

 

분석 목적	최우선 기준
FIH / early PK	재현성, 속도
Late phase PK	robustness, ISR
TDM	matrix tolerance
Metabolite profiling	cleanliness
Ultra-low LLOQ	sensitivity
High-throughput	simplicity

이 기준을 무시하고
“예전에 쓰던 방법”을 그대로 적용하면
대부분 중·후반에서 문제가 발생한다.

2. Protein Precipitation (PPT): 가장 단순하지만 가장 위험한 선택

2.1 PPT의 본질

Protein precipitation은
유기용매(acetonitrile, methanol 등)를 이용해
단백질을 침전시키고
상등액을 분석하는 방식이다.

• 빠르다
• 쉽다
• 장비 의존도가 낮다

그래서 FIH부터 임상까지
가장 널리 사용된다.

2.2 PPT의 숨겨진 전제

PPT는 사실
다음 가정 위에서만 잘 작동한다.

• analyte가 protein binding에서 쉽게 분리된다
• matrix 간 차이가 크지 않다
• interference가 허용 범위 내다

이 전제가 깨지는 순간,
PPT는 가장 불안정한 전처리법이 된다.

2.3 PPT의 대표적 실패 패턴

실무에서 자주 마주치는 문제는 다음과 같다.

• matrix effect가 subject마다 다르게 발생
• lipemic / hemolyzed sample에서 signal collapse
• ADA 존재 시 recovery 급감
• long run에서 baseline contamination 누적

특히 ADA interference가 있는 프로젝트에서는
PPT 기반 LC-MS/MS PK 데이터가
실제 exposure를 과소평가하는 경우가 많다.

2.4 PPT가 가장 적합한 상황

그럼에도 불구하고
PPT가 최선인 경우는 분명히 존재한다.

• FIH / SAD / MAD 초기
• wide therapeutic window drug
• high-throughput screening
• exploratory PK

이때 PPT의 가치는
정확도보다 ‘안정적인 평균값’에 있다.

3. Solid-Phase Extraction (SPE): 가장 이상적이지만 가장 까다로운 선택

3.1 SPE의 기본 개념

SPE는
sorbent와 analyte의 상호작용을 이용해
선택적으로 analyte를 포집·용출하는 방식이다.

• 높은 clean-up 효율
• matrix effect 감소
• sensitivity 향상

이론적으로는
LC-MS/MS에 가장 이상적인 전처리다.

3.2 SPE의 현실적인 함정

문제는
SPE가 가장 많은 변수를 가진 전처리라는 점이다.

• cartridge chemistry
• lot-to-lot variability
• conditioning / washing 조건
• operator skill

SPE는
“잘 되면 최고, 안 되면 재앙”인 방법이다.

3.3 ISR 실패의 숨은 주범

Late phase PK에서
ISR 실패가 반복될 때
SPE가 원인인 경우가 많다.

• cartridge lot 변경
• washing step 미세 변화
• 자동화 장비 drift

QC는 통과하지만
in-study sample만 흔들리는
가장 설명하기 어려운 패턴을 만든다.

3.4 SPE가 반드시 필요한 경우

그럼에도 SPE가 유일한 해법인 상황이 있다.

• ultra-low LLOQ 요구
• endogenous interference 심각
• regulatory critical study
• metabolite / impurity 정량

이 경우 분석팀의 역량은
LC-MS가 아니라 SPE 최적화 경험에서 갈린다.

4. Liquid–Liquid Extraction (LLE): 고전적이지만 여전히 강력한 선택

4.1 LLE의 본질

LLE는
유기상과 수상의 분배 차이를 이용해
analyte를 분리하는 방식이다.

• 물리화학적 원리가 명확
• matrix 제거 효율 우수
• 비교적 재현성 높음

“옛날 방식”이라는 인식과 달리
지금도 특정 상황에서는
가장 신뢰도 높은 방법이다.

4.2 LLE의 구조적 한계

하지만 LLE는 다음과 같은 단점을 가진다.

• labor-intensive
• 자동화 어려움
• emulsion 문제
• throughput 제한

대규모 임상이나 TDM에는
현실적으로 적용이 어렵다.

4.3 LLE가 빛나는 영역

LLE는 다음 분석 목적에서
여전히 경쟁력이 있다.

• non-polar small molecule
• severe matrix effect 문제
• legacy compound
• reference method 구축

특히
“왜 이 분석값이 흔들리는지 모르겠다”는 상황에서
LLE는 문제 원인 분리용 gold standard 역할을 한다.

5. 분석 목적별 전처리 선택 전략

5.1 FIH / Early Phase PK

• 권장: PPT
• 이유: 속도, 재현성, 단순성
• 주의: ADA 가능성, matrix variability

5.2 Late Phase / Pivotal PK

• 권장: SPE (또는 SPE + PPT hybrid)
• 이유: robustness, ISR 대응
• 주의: cartridge 관리, validation 범위

5.3 TDM (Therapeutic Drug Monitoring)

• 권장: PPT 또는 minimal SPE
• 이유: speed, operator independence
• 주의: patient matrix diversity

5.4 Metabolite / Impurity Analysis

• 권장: SPE 또는 LLE
• 이유: cleanliness, selectivity
• 주의: recovery bias

6. “정량 정확도” vs. “데이터 해석 가능성”

전처리 선택에서
분석팀이 자주 빠지는 함정은 이것이다.

정확도가 높은 방법 = 좋은 방법

하지만 실제 임상 데이터에서는
다음이 더 중요하다.

• trend consistency
• subject 간 비교 가능성
• explanation 가능성

때로는
PPT로 얻은 덜 깨끗한 데이터가
SPE로 얻은 깨끗하지만 흔들리는 데이터보다
훨씬 가치가 있다.

7. Hybrid 접근: 하나만 고집하지 말 것

최근 분석팀에서 증가하는 전략은
hybrid sample preparation이다.

• PPT → SPE clean-up
• PPT primary, SPE confirmatory
• LLE as reference method

이는 전처리를
“하나의 정답”이 아니라
목적별 도구 세트로 바라보는 관점이다.

8. 분석팀 실무자 체크리스트

전처리 선택 전

• 분석 목적 명확화
• required LLOQ 정의
• matrix variability 예측

개발 단계

• recovery vs matrix effect trade-off 평가
• ISR 가능성 고려
• ADA interference 가능성 검토

운영 단계

• lot 변경 관리
• long-run contamination 모니터링
• 문제 발생 시 대안 전처리 확보

결론: 전처리는 기술이 아니라 전략이다

Protein precipitation, SPE, LLE 중
“가장 좋은 전처리”는 존재하지 않는다.

존재하는 것은 단 하나다.

“지금 이 분석 목적에서
가장 덜 위험한 선택”

전처리는
LC-MS/MS 분석의 부속 단계가 아니다.

그 자체가

• 데이터의 성격을 결정하고
• 해석 가능성을 좌우하며
• 프로젝트 성공 여부를 가른다.

분석팀이 전처리를
기술이 아닌 전략으로 다루기 시작할 때,
LC-MS/MS 데이터는
비로소 임상을 움직이는 정보가 된다.