극미량 약물(ng→pg/mL) 분석을 위한 UHPLC‑MS/MS 감도 극대화 기술

 ‘검출 한계’를 넘어서 ‘신뢰 가능한 정량’으로

신약 개발 초기 단계, pediatric PK, micro‑sampling 기반 TDM, 장기 투여 약물의 trough level 평가 등에서 ng/mL 이하, 나아가 pg/mL 수준의 극미량 약물 정량은 더 이상 특수한 연구 주제가 아니다. 국내 제약사 분석팀에서도 이러한 요구는 일상화되고 있으며, 단순히 장비 성능만으로는 해결되지 않는 전처리–크로마토그래피–이온화–검출–데이터 처리 전반의 통합적 설계가 필요하다.

본 글에서는 UHPLC‑MS/MS를 기반으로 극미량 분석에서 감도를 결정짓는 핵심 기술 요소를 실무 관점에서 체계적으로 정리한다. 단순한 ‘감도 높이는 팁’이 아니라, 왜 특정 전략이 필요한지, 그리고 어디까지가 물리적·분석학적 한계인지를 구분하는 데 초점을 둔다.

1. 극미량 분석에서 ‘감도’의 정확한 정의

1.1 LLOQ와 sensitivity를 혼동하지 말 것

실무에서 감도는 종종 LLOQ 하나로 축약된다. 그러나 pg/mL 분석에서는 다음 세 요소를 분리해서 생각해야 한다.

• LOD: 신호 존재 여부를 판단할 수 있는 한계
• LLOQ: 정확도·정밀도를 만족하는 정량 한계
• Practical sensitivity: 실제 study sample에서 유지 가능한 감도

장비 데모에서 pg/mL가 가능하더라도, ISR·matrix variability·long batch 운용까지 고려하면 실제 usable sensitivity는 훨씬 낮아진다.

2. Sample Preparation: 감도의 70%는 전처리에서 결정된다

2.1 단백 침전(PPT)의 한계와 개선 방향

PPT는 가장 간편하지만, pg/mL 분석에서는 명확한 한계가 있다.

• dilution effect로 인한 신호 감소
• matrix residue에 따른 background 증가

실무적 개선 전략

• low‑volume PPT (20–50 µL scale)
• evaporation + reconstitution 병행
• post‑column infusion으로 background 평가 필수

2.2 SPE: 극미량 분석의 표준 전략

pg/mL 분석에서 SPE는 선택이 아니라 기본이다.

핵심 포인트

• loading volume 극대화 (≥500 µL)
• breakthrough 확인 필수
• wash 단계에서 signal loss vs noise 감소 trade‑off 평가

특히 mixed‑mode SPE는 극미량 분석에서 가장 강력하지만 가장 위험한 도구다. pH 0.2 차이로도 회수율이 급변한다.

2.3 Micro‑elution SPE와 감도

Micro‑elution plate는 농축 효과를 극대화할 수 있다.

• elution volume: 10–30 µL
• evaporation 최소화 → analyte loss 방지

다만 plate 간 reproducibility 확보가 중요하다.

3. UHPLC 조건 최적화: peak를 ‘날카롭게’ 만드는 기술

3.1 Column 선택

• sub‑2 µm particle
• narrow bore (2.1 mm → 1.0 mm)

이는 단순한 분리 문제가 아니라 peak height 증폭 전략이다.

3.2 Gradient 설계

극미량 분석에서 retention time 안정성은 감도와 직결된다.

• initial organic % 최소화
• analyte elution 구간 집중

불필요한 gradient 길이는 noise만 증가시킨다.

3.3 Injection volume의 역설

무조건 많이 넣는다고 감도가 올라가지 않는다.

• solvent mismatch → peak broadening
• column overload 위험

권장 전략: on‑column focusing을 고려한 injection solvent 설계

4. Ionization: ESI 효율 극대화의 실제

4.1 Flow rate와 감도

• 300 µL/min → 50 µL/min 이하로 낮추면
• ionization efficiency는 기하급수적으로 증가

Micro‑flow LC는 pg/mL 분석에서 사실상 필수 기술로 이동 중이다.

4.2 Source 조건의 ‘미세 조정’

• desolvation temperature
• gas flow balance

극미량 분석에서는 source cleanliness가 곧 감도다.

4.3 Adsorption 문제

pg/mL 수준에서는 analyte가 튜브, vial, needle에 흡착된다.

• low‑binding plastic
• silanized glass vial 비교 필수

5. MS/MS 설정: transition 하나가 감도를 좌우한다

5.1 Precursor 선택

• 가장 abundance 높은 ion ≠ 가장 stable ion

isotope pattern, adduct 형성까지 고려해야 한다.

5.2 Product ion 최적화

• low‑m/z fragment는 background 위험
• high‑m/z fragment는 sensitivity 저하

multi‑transition 전략으로 안정성 확보

5.3 Dwell time과 cycle time

pg/mL 분석에서는 dwell time을 과감히 늘려야 한다.

• 불필요한 transition 제거
• scheduled MRM 적극 활용

6. Background noise 관리 전략

6.1 Blank의 재정의

• solvent blank
• matrix blank
• processed blank

이 세 가지를 구분하지 않으면 pg/mL 분석은 성립하지 않는다.

6.2 Carryover 관리

• needle wash solvent 조합
• high‑organic wash + modifier

carryover는 극미량 분석에서 ‘가짜 신호’를 만든다.

7. Calibration 전략과 LLOQ 설정

7.1 Calibration range 설계

• wide range는 금물
• low‑end 중심 calibration

7.2 Weighting factor

• 1/x²가 항상 정답은 아니다
• residual plot 기반 결정 필요

8. Validation과 ISR에서의 현실적인 접근

pg/mL 분석에서 모든 guideline를 기계적으로 적용하면 실패한다.

• accuracy ±20% 허용 논리
• biological relevance 중심 해석

ISR 실패는 종종 분석 실패가 아니라 matrix variability의 반영이다.

9. 실무 체크리스트

• SPE 기반 농축 전략 적용
• micro/nano‑flow 가능성 검토
• adsorption 테스트 수행
• background source 분리 평가
• dwell time 재설계
• calibration low‑end 검증

결론

극미량 약물 분석은 장비 성능 경쟁이 아니다. 얼마나 많은 신호를 만들어내느냐가 아니라, 얼마나 의미 있는 신호만 남기느냐의 문제다.

UHPLC‑MS/MS를 이용한 pg/mL 분석의 핵심은 단 하나다.

“모든 단계를 감도를 기준으로 다시 설계하라.”

그 순간, ng/mL의 벽은 생각보다 쉽게 무너진다.

극미량 약물(ng→pg/mL) 분석을 위한 UHPLC‑MS/MS 감도 극대화 기술