Carry-over 최소화를 위한 Autosampler 세척 및 Matrix-dependent Blank 관리

– Bioanalytical Method Validation 중 흔한 오염 문제 해결 전략

 

Carry-over 최소화를 위한 Autosampler 세척 및 Matrix-dependent Blank 관리

1. 서론: “Carry-over”는 왜 항상 Validation 단계에서 문제를 일으키는가

LC-MS/MS 기반 생체시료 분석에서 가장 자주 듣는 문구 중 하나가 있다.

“왜 blank 시료에서 피크가 계속 올라오지?”

Method validation 단계에서 예상치 못한 carry-over 신호가 blank에서 관찰되면,
그 원인을 찾느라 며칠, 혹은 몇 주를 허비하는 경우가 많다.

특히 low LLOQ (0.1 ng/mL 이하) 수준의 고감도 분석법에서는
극미량의 오염(cross-contamination)도 정량 결과를 왜곡시킬 수 있다.
즉, carry-over 문제는 단순한 실험적 불편함이 아니라, 정확도(accuracy)와 규제 적합성(regulatory compliance)을 흔드는 치명적 요인이다.

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2. Carry-over의 근본 원인

Carry-over는 단일 요인보다는 여러 가지 “소량 잔류 현상”이 복합적으로 작용해 발생한다.
아래는 LC-MS/MS 시스템 내 주요 오염 경로이다.

구분	주요 부위	오염 원인	비고
Autosampler	Injection needle, loop, seat	고농도 샘플 후 잔류 용액	세척 solvent 조성 중요
LC system	Column inlet, valve	column trapping, valve bleed	gradient delay line 영향
MS interface	ESI probe, cone	non-volatile matrix 성분 부착	장시간 축적형 오염
Vial/Tips	Sample evaporation, adsorption	Protein/PE material 잔류	matrix effect 유발

특히 biological matrix (plasma, urine)는 단백질, 인지질, 염류 등 다양한 endogenous compound를 포함하고 있어
blank matrix라도 완전한 “zero signal”을 기대하기 어렵다.
이 때문에 carry-over와 matrix-dependent noise는 항상 함께 관리해야 한다.

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3. Carry-over의 종류: 분석자가 구분해야 할 3가지 시나리오

(1) System carry-over

• 원인: Needle, injection port, loop 잔류물
• 특징: Blank injection 직후 이전 sample의 peak가 그대로 나타남
• 해결: 세척 solvent 강화, needle seat 교체, loop flushing volume 증대

(2) Column carry-over

• 원인: 분석 column에 약물이 trap되어 늦게 용출됨
• 특징: Blank에서 tailing된 broad peak, retention time 지연
• 해결: wash gradient 설정, column backflush, stationary phase 변경

(3) Matrix carry-over (Pseudo carry-over)

• 원인: Blank matrix 자체의 내인성 간섭(interference)
• 특징: Blank에서도 target MRM transition에 신호가 발생
• 해결: MRM transition 변경, MS parameter 최적화, matrix-matched calibration 적용

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4. Autosampler 세척 전략: “한 번의 wash”가 모든 걸 바꾼다

Carry-over를 가장 효과적으로 줄이는 방법은
autosampler의 needle 및 seat 세척(solvent wash) 절차를 최적화하는 것이다.

4.1 세척 solvent의 구성 원칙

세척 용매의 목적은 “잔류 시료 용해 + 단백질/인지질 제거”이다.
따라서 화학적 polarity balance가 중요하다.Solvent 조합세척 효과비고

 

Solvent 조합	세척 효과	비고
MeOH : Water (50:50)	기본 오염 제거	기본 구성
IPA : Water (70:30)	지질 잔류 제거	인지질성 matrix에 효과적
MeOH : IPA : ACN (1:1:1)	광범위한 용해력	peptide-like 물질에 유리
+0.1% FA 또는 0.05% NH₄OH	이온성 화합물 제거	analyte 특성에 따라 산/염기 조정

보통 needle wash A (acidic) / needle wash B (basic) 두 종류를 병렬 세팅하여
각 injection 전·후로 자동 세척하도록 설정하는 것이 이상적이다.
예:

• Wash A: 0.1% formic acid in 50:50 MeOH:Water
• Wash B: 0.05% NH₄OH in 70:30 IPA:Water

이 두 세척액을 번갈아 사용하면 acid/base 성분에 따른 잔류 오염을 모두 제거할 수 있다.

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5. Needle seat & loop contamination 관리

5.1 Needle seat의 문제

LC system에서 가장 심각한 오염이 누적되는 부위는 needle seat이다.
특히 고농도 샘플이 연속 주입될 경우,
needle tip을 통해 미세한 시료 방울이 seat 내부에 스며들어 잔류한다.

이 잔류물이 이후 blank injection 시 ghost peak 형태로 재검출된다.
따라서 다음과 같은 관리가 필요하다.

• 매일 run 종료 후 seat flush (IPA) 수행
• 한 주 단위로 seat insert 교체
• QC 결과에서 carry-over 경향이 보이면 즉시 seat 재점검

 

6. Column wash 및 gradient 설정

6.1 Gradient wash step 추가

Carry-over는 종종 column에 흡착된 analyte가 늦게 용출되면서 발생한다.
따라서 gradient wash step을 설정해주는 것이 매우 중요하다.

예시:

 

95% B 유지 (1 min) → 100% B (1 min hold) → 5% B (0.5 min re-equilibration)

이러한 “strong solvent hold” 단계는 column 내 잔류물을 완전히 제거해준다.

6.2 Column chemistry 선택

• C18 → Phenyl-Hexyl 변경 시 aromatic compound carry-over 감소
• Amino, Polar embedded phase 사용 시 basic compound retention 완화
• 분석 대상 약물이 amphiphilic 성질일 경우, HILIC column 검토 가능

 

7. Matrix-dependent Blank 관리 전략

Carry-over와 가장 혼동되는 문제는 “matrix-dependent blank peak”이다.
즉, blank plasma에서도 target transition (예: m/z 450 → 150)에 신호가 검출되는 현상이다.

이것은 carry-over가 아니라 matrix interference에 가깝다.
따라서 이를 해결하기 위해서는 blank batch 관리가 필수이다.

Blank 유형	목적	관리 전략
Solvent blank	System contamination 확인	분석 batch 시작 시
Matrix blank	Endogenous interference 확인	각 matrix lot별 6회 이상 측정
Processed blank	Extraction 과정 오염 확인	전처리 단계 병행 blank 사용

특히 plasma lot 간 내인성 물질 조성 차이가 크므로,
validation 시 최소 6개 donor plasma를 사용하여 blank matrix를 교차 비교해야 한다.
FDA M10 가이드라인(2022)에서도 이를 명시하고 있다.

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8. Carry-over 평가 기준 (Regulatory guidance)

FDA와 EMA의 bioanalytical guideline은 carry-over를 다음과 같이 정의한다.

“The response of the analyte in the blank sample following the injection of the high concentration sample should not exceed 20% of the LLOQ response and 5% for the IS.”

즉, high standard나 ULOQ 시료를 주입한 후 blank를 분석했을 때
LLOQ 대비 20% 이하의 신호라면 허용 가능하다는 의미다.
그러나 실제 실험에서는 10% 이하로 유지되는 것이 이상적이다.

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9. 실무 사례: Validation 중 carry-over 발생과 해결

사례 1️⃣ – 항암제 candidate A

• 현상: ULOQ (500 ng/mL) 주입 후 blank에서 12% 수준의 carry-over 발생
• 원인: Needle seat 내부 오염
• 해결: Needle wash에 IPA 70% + 0.1% FA 추가 → carry-over 2% 이하로 감소

사례 2️⃣ – CNS drug candidate B

• 현상: Blank matrix에서 broad peak 형성
• 원인: Endogenous phospholipid interference (m/z overlap)
• 해결: MRM transition 재설정 (precursor 2 Da 이동) → ghost peak 소멸

사례 3️⃣ – Peptide drug candidate C

• 현상: Column에 trapping된 peptide tailing
• 원인: Hydrophobicity 높은 stationary phase
• 해결: C18 → Phenyl-hexyl column 교체 + wash gradient 추가

이러한 사례들은 대부분 세척액 강화, blank matrix 관리, column chemistry 변경만으로
carry-over 문제를 해결할 수 있음을 보여준다.

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10. 예방적 관리 전략 요약

구분	핵심 조치	점검 주기
Needle wash solvent	산성/염기성 병행 세척액 구성	일일
Needle seat	Flush 및 insert 교체	주 1회
Column wash	Strong solvent gradient 설정	Method 내 반영
Blank matrix	6 donor 이상 평가	Validation 단계
Sample queue	ULOQ → Blank 순서 제한	Routine 분석 시
Batch QC	Carry-over monitor QC 추가	Batch별 1회

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11. 결론

Carry-over는 단순히 “장비 세척이 부족한 문제”가 아니다.
이는 시료의 화학적 특성, matrix의 복잡성, autosampler 구조, column 화학적 상호작용 등
복합적 요인이 얽혀 나타나는 분석 시스템 전체의 품질 이슈이다.

따라서 분석팀은 단순한 wash 강화보다,

• matrix-dependent blank 관리,
• solvent polarity balancing,
• column-specific gradient 설정,
• validation 중 carry-over trending 분석 등을 종합적으로 수행해야 한다.

이러한 관리 체계가 정착되면,
LC-MS/MS 기반 bioanalytical method validation의 reproducibility는 비약적으로 향상된다.

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📊 핵심 정리

구분	주요 원인	해결 전략
System carry-over	Needle/loop 잔류	산·염기성 needle wash 병행
Column carry-over	Column trapping	Strong wash gradient 설정
Matrix interference	Endogenous ion overlap	Transition 변경, blank screening
Needle seat contamination	Seat 내부 잔류	IPA flush, seat 교체
Validation 관리	Blank 평가 미흡	6-donor matrix 평가, QC carry-over 모니터링