LC Gradient Delay 및 Dwell Volume이 Quantitation Reproducibility에 미치는 영향 분석

LC Gradient Delay 및 Dwell Volume이 Quantitation Reproducibility에 미치는 영향 분석

 

– LC 시스템 간 Method Transfer 시 놓치기 쉬운 정량 정확도의 함정

1. 서론 – “Retention time drift, 그 뒤에는 항상 system volume이 있다”

LC-MS/MS 기반 bioanalytical quantitation에서는 gradient 조건의 재현성(reproducibility)이 데이터의 일관성을 결정한다.
하지만 많은 분석자들이 method validation 시 gradient time, flow rate, mobile phase 조성에만 집중하고,
정작 시스템 고유의 dwell volume 또는 gradient delay volume은 간과하는 경우가 많다.

결과적으로 동일한 LC gradient 조건을 입력했음에도
장비 모델(Sciex ExionLC, Agilent 1260, Waters Acquity)에 따라 retention time이 0.2–0.5분 이상 차이나며,
이는 결국 peak separation, matrix interference, quantitation drift로 이어진다.

즉, gradient delay와 dwell volume은 단순한 장비 사양이 아니라,

정량 reproducibility를 결정짓는 숨은 변수(hidden variable)다.

2. Gradient delay와 dwell volume의 개념 정의

2.1 Gradient delay (또는 delay time)

Gradient delay는 펌프에서 혼합된 mobile phase가 컬럼 전단에 도달하기까지 걸리는 시간을 의미한다.
즉, 실제 gradient가 컬럼에 적용되기까지의 ‘지연 시간’이다.

이 지연은 다음과 같은 부피에 의해 결정된다:

• 펌프 헤드 내부 volume
• mixer 및 proportioning valve volume
• connecting tubing (펌프 → injector → column)
• autosampler 내부 dead volume

Gradient delay time (min) = Dwell volume (mL) / Flow rate (mL/min)

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2.2 Dwell volume (또는 gradient delay volume)

Dwell volume은 gradient delay를 초래하는 물리적 부피의 총합으로,
“gradient가 실제 컬럼에 도달하기까지 통과해야 하는 mobile phase의 체적”을 의미한다.

구성 요소	Volume
Pump head + mixing chamber	200–500 µL
Autosampler + tubing	100–300 µL
Valve + connector	50–100 µL
Total (typical dwell volume)	350–900 µL

즉, dwell volume이 클수록 gradient가 컬럼에 도달하는 시간이 길어지며,
retention time이 전체적으로 늦어지고 separation profile이 왜곡된다.

3. LC 시스템 간 dwell volume 비교

 

제조사	시스템	Mixing type	Typical dwell volume (µL)
Waters Acquity UPLC	Binary (low volume)	In-line static	200–300
Agilent 1260 Infinity	Quaternary	Active mixer	800–1200
Sciex ExionLC AD	Binary	Dynamic mixer	400–600
Shimadzu Nexera X3	Binary	Low volume mixer	300–400
Thermo Vanquish Horizon	Binary	High-pressure mixing	200–300

따라서 Waters UPLC에서 개발된 gradient method를 Agilent 1260으로 옮기면
dwell volume 약 3–4배 차이로 인해 retention time이 0.3–0.6분 이상 지연된다.

4. Gradient profile 왜곡의 실제 예

예를 들어, 다음 gradient를 가정해보자:

 

Time (min)	%B (유기용매)
0.0	5
3.0	95
4.0	95
4.1	5
5.0	5

Flow rate = 0.4 mL/min
Dwell volume = 400 µL (시스템 A), 800 µL (시스템 B)

이때 gradient delay time은:

• A: 0.4 / 0.4 = 1.0 min
• B: 0.8 / 0.4 = 2.0 min

즉, 시스템 B에서는 실제 gradient 시작이 1분 늦게 컬럼에 도달하므로,
모든 피크가 평균적으로 1분 뒤로 이동하게 된다.

이 retention shift는 단순 시간 차이를 넘어서,
fast gradient나 short column(2.1×50 mm) 조건에서는 peak overlap을 유발하며,
결국 quantitation reproducibility에 직접적인 영향을 미친다.

5. Quantitation reproducibility에 미치는 구체적 영향

5.1 Retention time shift에 따른 IS–analyte alignment 붕괴

LC-MS/MS 정량에서 내부표준(IS)은 동일한 retention 환경에서 분석되어야 matrix effect를 정확히 보정할 수 있다.
그러나 dwell volume 차이로 analyte와 IS의 retention alignment가 어긋나면,
두 피크의 ionization environment가 달라져 보정 효율이 저하된다.

📉 결과: %CV 증가 (intra-day, inter-day precision 저하)

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5.2 Peak separation 및 matrix interference

Matrix 성분(특히 phospholipid, endogenous metabolite)의 elution profile은 gradient 시작점에 민감하다.
Dwell volume이 클수록 hydrophobic matrix가 늦게 용출되어 analyte 피크에 중첩될 수 있다.

→ 결과적으로 ion suppression, peak distortion 발생 → signal intensity 변동

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5.3 Calibration curve slope drift

Gradient delay가 큰 시스템에서 calibration curve를 반복 측정하면 slope가 점진적으로 변하거나
low QC에서 %bias가 증가하는 현상이 발생한다.

이는 gradient composition이 완전히 안정화되지 않은 초기 구간에서
analyte의 retention과 이온화 효율이 일관되지 않기 때문이다.

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5.4 Reproducibility degradation in cross-system transfer

• 개발 시스템: Waters UPLC (dwell volume 250 µL)
• 검증 시스템: Agilent 1260 (dwell volume 900 µL)
  → retention time +0.45 min shift, slope 15% 감소, low QC %bias = +10%

결국, 같은 gradient 조건이라도 시스템 물리적 차이로 정량 reproducibility가 손상된다.

 

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6. Gradient delay 및 dwell volume 측정 방법

6.1 측정 원리

Dwell volume은 UV detector로 gradient 도달 시간을 측정하여 산출한다.

6.2 실험 예시

1️⃣ A 용매: H₂O, B 용매: 0.1% acetone in H₂O
2️⃣ Gradient: 0–100% B over 10 min
3️⃣ Flow rate: 1.0 mL/min
4️⃣ Column: 제거 (union 연결)
5️⃣ UV 검출: 265 nm

→ UV absorbance 상승 시점을 기준으로 delay time을 측정
→ dwell volume = delay time × flow rate

7. Quantitation reproducibility 확보를 위한 보정 전략

7.1 Gradient delay matching

시스템 간 transfer 시 다음 중 하나를 수행한다:

• delay volume이 작은 시스템에서는 tubing 추가로 volume 증가
• delay volume이 큰 시스템에서는 gradient 시작 시점 보정 (negative offset) 적용

예: dwell volume 차이 0.4 mL, flow rate 0.4 mL/min
→ delay offset = 1.0 min
즉, 새로운 시스템 gradient table에서 1.0분 앞당겨 gradient 시작

7.2 Column void volume 기준으로 gradient 설계

컬럼 내부 부피(약 0.2–0.3 mL for 2.1×50 mm)는 dwell volume에 비해 작지만,
gradient 시작점을 컬럼 dead volume 이후로 설계하면 reproducibility 향상.

7.3 System suitability check

Gradient delay를 validation protocol에 포함:

• Retention time RSD ≤ 0.2%
• Slope deviation ≤ 5% across systems
• Matrix IS ratio consistency (CV ≤ 10%)

8. 국내 제약사 사례 – Gradient delay 관리 전략

유한양행	Agilent 1290 + Sciex 6500	Gradient delay <0.3 min 유지, 6개월마다 재검증
대웅제약	Shimadzu Nexera	Column + union dead volume 포함 전체 system volume 산출 후 기록 관리
삼성바이오에피스	Waters UPLC-Hclass	Low-volume head 선택으로 system delay 최소화

이처럼 국내 제약사들은 LC-MS/MS method validation의 reproducibility 확보를 위해
dwell volume 측정–보정 절차를 표준 SOP 수준으로 관리하고 있다.

9. 실험적 최적화 팁

1️⃣ System tubing 최소화
→ 필요 이상 길이의 PEEK 튜브 제거, 0.005" i.d. 사용

2️⃣ Binary mixing head 사용
→ Quaternary 대비 dwell volume 약 40~60% 감소

3️⃣ Autosampler rinse 설정 최적화
→ sample loop dead volume 내 solvent mixing 최소화

4️⃣ Gradient stabilization time 확보
→ Injection 전 최소 2–3 column volume flushing

5️⃣ QC injection 간 retention time monitoring
→ deviation >0.05 min 발생 시 dwell volume drift 점검

10. 결론 – “LC gradient reproducibility는 volume physics에서 시작된다”

Gradient delay와 dwell volume은 단순한 ‘장비 사양’이 아니라,
LC-MS/MS quantitation reproducibility의 물리적 기반이다.

SOP 수준의 관리 없이 method transfer만 수행하면,
retention shift, matrix suppression, slope drift 등의 문제가 연쇄적으로 발생한다.

Gradient reproducibility = Volume reproducibility.

결국, 진정한 정량 정확도는 전처리(skill)가 아니라
시스템 물리적 이해(physical insight)에서 비롯된다.

📊 핵심 요약 표

항목	영향 요인	정량 reproducibility 영향	보정 전략
Dwell volume	Pump + mixer + tubing	Retention shift, slope drift	Delay offset 적용
Gradient delay	Flow rate + dwell volume	IS alignment 불일치	Gradient 시작 보정
Mixing efficiency	Pump type (binary vs quaternary)	Signal 변동, baseline noise	Low-volume head 선택
Column void volume	Column length, ID	Gradient 도달 시점 불명확	Dead volume 고려 설계