Low-volume Plasma 분석을 위한 고감도 LC-MS/MS Method Optimization 전략

– 소아 및 고령 환자 대상 혈액 제한 환경에서의 Sensitivity 확보

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1. 서론: 소량 혈액에서 정량 분석의 필요성과 도전 과제

최근 임상 연구의 패러다임이 바뀌고 있다.
특히 소아(pediatric), 고령(geriatric) 환자군을 대상으로 한 약동학(Pharmacokinetics, PK) 연구에서는
“시료 채취의 부담을 최소화하면서도 신뢰성 있는 약물 농도 데이터를 확보하는 것”이 필수가 되었다.

과거에는 혈액 200~500 μL 단위의 샘플을 채취하여 LC-MS/MS로 분석하는 것이 일반적이었지만,
소아 환자에서는 단 한 번의 채혈로 얻을 수 있는 양이 50 μL 이하인 경우도 많다.
또한 고령 환자의 경우 반복 채혈이 어려워, 분석 가능한 샘플의 수와 양이 제한적이다.

이러한 이유로 최근 제약업계에서는 “Low-volume bioanalysis”, 즉 50 μL 이하의 소량 혈장(plasma)으로도
정확한 약물 농도 정량이 가능한 초고감도(ultrasensitive) LC-MS/MS 분석법 개발이 핵심 기술로 떠오르고 있다.

2. Low-volume Bioanalysis의 기술적 도전

2.1 Matrix effect와 Signal suppression

소량 시료에서는 plasma 내 endogenous compound가 상대적으로 농축되기 때문에,
matrix effect (이온화 억제/증폭) 현상이 훨씬 두드러진다.
이는 특히 early retention region (0.5–2.0 min) 구간에서 심각하게 나타나며,
low-level QC의 precision이 20% 이상 흔들리는 원인이 된다.

2.2 Sample loss와 adsorption

채취된 시료가 적을수록 샘플 손실(sample loss)의 영향이 치명적이다.
튜브 벽, tip, vial 표면에 약물이 흡착되면 실제 injection 농도는 절반 이하로 감소할 수 있다.
따라서 low-binding polypropylene tube 또는 siliconized glass vial 사용이 필수적이다.
이 부분은 아래의 “5. 실무적 팁”에서 구체적으로 다룬다.

2.3 Quantification limit의 한계

일반 LC-MS/MS의 LLOQ (Lower Limit of Quantification)은 보통 0.1–1 ng/mL 수준이다.
하지만 micro-sampling (20 μL blood) 환경에서는 0.01 ng/mL 이하의 감도가 요구된다.
이는 기존의 sample volume scaling으로는 불가능하며, LC 시스템 및 MS detector 최적화가 필요하다.

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3. 감도 향상을 위한 기술적 접근

3.1 LC 부분 – Microflow/Nanoflow LC 도입

 

구분	Conventional LC	Microflow LC	Nanlflow LC
Flow rate	0.3–1.0 mL/min	5–50 μL/min	<1 μL/min
Column ID	2.1 mm	0.5–1.0 mm	75–150 μm
Sensitivity	보통	3–5배 ↑	10배 이상 ↑
Sample consumption	높음	중간	매우 낮음

특히 Microflow LC-MS/MS는 감도 향상과 reproducibility를 모두 확보할 수 있는 현실적 대안이다.
한미약품, 대웅제약 등 국내 분석팀에서는 실제 Agilent 6495C + Eksigent MicroLC 200 조합으로
micro-sampling 기반 PK 연구를 수행한 사례가 있다.

• Microflow LC는 spray stability가 높아, nanoLC 대비 분석 재현성이 우수하다.
• sample injection volume이 작아도 peak concentration factor가 높아 S/N ratio가 개선된다.

3.2 MS 부분 – Ion funnel, high-efficiency source 활용

Triple quadrupole MS의 감도는 기본적으로 ion transmission efficiency에 의존한다.
최신 장비(예: SCIEX 7500, Agilent 6495C, Thermo TSQ Altis)는
ion funnel, jet stream, orthogonal spray 등의 기술을 활용해
기존 대비 최대 5~10배의 감도 향상을 달성한다.

또한 MRM dwell time optimization을 통해 signal-to-noise 비를 극대화할 수 있다.
(단, transition 수가 많은 multi-analyte assay에서는 dwell time 분배 최적화가 필요함)

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4. 전처리(Pre-treatment) 전략: Recovery와 Matrix Effect의 균형

4.1 Protein precipitation (PPT)

• 단순하고 빠르지만, low-concentration sample에서는 recovery variability가 커진다.
• acidified organic solvent (예: 0.1% formic acid in ACN)를 사용하면 회수율을 5–10% 개선 가능.

4.2 Liquid–liquid extraction (LLE)

• Matrix component 제거에는 탁월하지만, volume scaling 시 reproducibility 문제 발생.
• 50 μL sample에서는 micro-LLE (0.5 mL solvent)를 이용해 회수율 유지 가능.

4.3 Solid phase extraction (SPE)

• SPE는 reproducibility 측면에서 가장 안정적.
• μElution plate (Waters Oasis, Phenomenex Strata-X)를 활용하면
  25 μL plasma에서도 높은 recovery 확보 가능.
• 특히 elution solvent volume <50 μL로 줄이면 재농축 없이 direct injection 가능.

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5. 실무 팁: Low-volume 분석 시 자주 간과되는 요소들

 

구분	문제 원인	해결 전락
Sample loss	튜브/팁 표면 흡착	Low-binding tube, pre-blocking(BSA, PEG)
Carry-over	Injection loop contamination	Needle wash solvent에 isopropanol + 0.1% FA 추가
Evaporation loss	Sample drying 중 휘발	30℃ 이하 gentle N₂ blow, 자동화 장비 사용
Autosampler precision	Small injection volume	2–5 μL 이하 시 internal loop 사용
QC variability	matrix effect	IS-normalized matrix factor 계산 및 correction

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6. 대체 접근법: Dried Matrix Spot (DBS, VAMS)

Low-volume 분석의 또 다른 대안으로 Dried Blood Spot (DBS) 또는
Volumetric Absorptive Microsampling (VAMS) 방식이 활용되고 있다.

이들은 plasma separation 과정 없이 whole blood 기반 quantitation을 가능하게 하며,
sample volume은 10–20 μL에 불과하다.

• 장점: 채혈 부담 최소화, 냉동보관 불필요, 운송 용이
• 단점: hematocrit effect, extraction variability
• 분석법 설계 시 plasma/DBS 간 conversion factor 계산이 필수

한편 LC-MS/MS로 DBS 분석 시에는 punch position에 따른 농도 차이가 발생할 수 있어,
spot homogenization 단계에서의 표준화가 중요하다.

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8. Validation 시 고려해야 할 통계적 요건

Low-volume assay validation에서는 precision, accuracy, recovery, matrix factor, carry-over 외에도
sample stability에 대한 추가 평가가 필요하다.

특히 freeze–thaw stability나 short-term bench-top stability는
volume scaling에 따라 다르게 나타나므로, 반드시 실제 분석 조건에서 재검증해야 한다.

FDA M10 가이드라인(2022)에 따르면,

“For assays utilizing small sample volumes, validation should demonstrate robustness of the extraction and quantitation process at the lowest volume used.”

즉, volume-dependent recovery stability가 입증되어야만 승인 가능하다는 의미다.

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9. 향후 전망: Automation과 AI 기반 Optimization

Low-volume 분석의 reproducibility 확보를 위해 최근에는 자동화(Automation) 기술이 도입되고 있다.
예를 들어, Hamilton, Tecan 등 liquid handling robot을 이용해
μElution SPE나 micro-LLE 과정을 자동화함으로써 pipetting variability를 줄이는 시도가 활발하다.

또한 AI 기반 optimization platform (예: Sciex OS-QC, Agilent MassHunter AI Assist)은
수천 개의 chromatographic condition을 가상 실험으로 평가해
최적 조건을 자동 제안하는 기능을 제공한다.
국내에서도 한미약품과 GC녹십자는 실제 method transfer 단계에서 이 기술을 검토 중이다.

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10. 결론

소아 및 고령 환자 대상 임상 연구에서는 혈액 채취량이 제한적이기 때문에,
전통적인 LC-MS/MS 방법으로는 충분한 감도와 재현성을 확보하기 어렵다.
이에 따라 분석팀은 micro-sampling, microflow LC, ion funnel, μElution SPE, low-binding tube 등
다양한 기술적 요소를 통합해 최적화된 low-volume 분석법을 설계해야 한다.

궁극적으로, 이러한 기술은 단순히 “감도 향상”을 넘어
임상 연구의 윤리적 부담을 줄이고,
정밀의학(personalized medicine)의 실현을 뒷받침하는 핵심 분석 기반이 될 것이다.

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🔎 요약 정리

핵심 요소	주요 전략	기대 효과
Sample prep	μElution SPE, acidified solvent	Recovery 향상, reproducibility 개선
LC system	Microflow LC	감도 ↑, sample volume ↓
MS system	Ion funnel, jet stream ESI	Signal gain 5–10배
Container	Low-binding tube	Adsorption 최소화
Validation	Volume-dependent robustness 평가	Regulatory 대응 가능
Automation	Robot 기반 μSPE	Operator variability 감소

Low-volume Plasma 분석을 위한 고감도 LC-MS/MS Method Optimization 전략