Solid-phase extraction (SPE) vs. Liquid-liquid extraction (LLE): Matrix Effect 비교 평가 – 분석 정확도 확보를 위한 전처리법 선택 가이드

 

1. 서론 – “전처리(pre-treatment)가 모든 정량의 시작이다”

LC-MS/MS 기반 생체시료 분석에서 가장 많은 시간을 투자하는 단계는 무엇일까?
분석 장비 튜닝도, gradient 설정도 아니다. 바로 시료 전처리(sample preparation)다.

어떤 전처리 방식을 택하느냐에 따라 matrix effect가 달라지고,
이는 곧 정량 정확도(accuracy)와 재현성(precision)의 차이로 이어진다.

즉, “SPE vs LLE”의 선택은 단순한 실험 효율의 문제가 아니라
데이터의 신뢰성(reliability)과 규제 적합성(regulatory compliance)을 좌우하는 핵심 결정이다.

 

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2. 전처리의 목적: 깨끗한 시료, 정확한 이온화

LC-MS/MS의 이온화 과정(특히 ESI mode)은 matrix component에 매우 민감하다.
Plasma, urine, tissue homogenate 등 복잡한 생체시료에는 단백질, 인지질, 염류 등이 포함되어 있으며,
이들은 이온화 억제(ion suppression) 또는 이온화 향상(ion enhancement) 현상을 유발한다.

이로 인해 동일한 농도의 analyte라도
시료의 종류나 lot에 따라 signal intensity가 달라지는 문제가 발생한다.

따라서 전처리의 목표는 단 하나 —

“Analyte는 남기고, 방해물질은 제거하라.”

이를 실현하기 위한 대표적인 두 방법이 바로 SPE (Solid-phase extraction)와 LLE (Liquid-liquid extraction)이다.

 

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3. LLE (Liquid-Liquid Extraction): 전통적이지만 강력한 분리법

3.1 원리

LLE는 두 상 간의 분배(coefficient partition)를 이용한다.
즉, 수용액상의 분석물(analyte)을 비혼합성 유기용매로 추출하는 방식이다.

분배계수(K)가 크면 analyte가 유기상으로 이동하고,
단백질이나 염류는 수상에 남는다.

3.2 주요 용매 조합

유기용매	특성	주요 용도
Ethyl acetate	비극성, 휘발성	약산성, 약염기성 화합물
Methyl tert-butyl ether (MTBE)	낮은 밀도, 낮은 수용성	약산성 화합물
n-Hexane	강한 비극성	지질성 물질
Dichloromethane	높은 밀도, 강한 용해력	polypeptide형 물질
Diethyl ether	빠른 휘발, 고효율	약염기성 화합물

3.3 장점

• 구조 단순한 소분자 약물에 최적
• 단백질, 염류 완벽 제거
• 고감도 LC-MS/MS 분석에 적합 (background 최소화)
• 시료 처리 속도가 빠름 (centrifuge 후 상 분리만으로 완료)

3.4 단점

• 분석물의 극성이 크면 회수율 저하
• 용매 선택 및 pH 최적화 필요 (acid-base 상태에 민감)
• batch 간 reproducibility 확보 어려움
• automation 적용 제한적 (manual step이 많음)

4. SPE (Solid-phase Extraction): 선택적 정제와 일관성의 강점

4.1 원리

SPE는 고체 흡착제(sorbent)에 분석물질을 선택적으로 붙이고,
불순물을 세척 후 용출(elution)하는 단계적 정제 방식이다.

단계는 다음과 같다:

1️⃣ Conditioning: sorbent 활성화 (MeOH → water)
2️⃣ Loading: 시료 주입 (analyte 흡착)
3️⃣ Washing: matrix 성분 제거
4️⃣ Elution: analyte 선택적 용출

4.2 주요 sorbent 종류

Sorbent	상호작용 매커니즘	주요 용도
C18 (reversed-phase)	소수성	비극성 약물
SAX/SCX	이온 교환	음이온/양이온 화합물
HLB (Hydrophilic-Lipophilic Balance)	복합 상호작용	polar/nonpolar 동시 분리
Mixed-mode (RP+Ion exchange)	혼합 메커니즘	복잡한 matrix (plasma 등)

4.3 장점

• 선택적 정제 (특정 기능기 중심의 분리)
• matrix removal 능력 우수 → low matrix effect
• 자동화 장비(positive pressure manifold, SPE robot)에 적용 용이
• reproducibility 우수

4.4 단점

• Cartridge 비용 높음
• 시료 종류에 따른 최적화 필수
• Elution solvent 잔류 시 재이온화 문제 발생 가능
• 처리 시간 LLE보다 다소 길다

5. Matrix Effect 평가의 핵심 개념

LC-MS/MS에서 matrix effect를 평가하기 위해 다음 세 가지 파라미터를 정의한다:

1️⃣ Recovery (%)

전처리 과정을 거친 시료에서 analyte의 회수율

2️⃣ Matrix Factor (MF)

분석 신호 = Pure solution / Post-extraction spiked sample
(1이면 matrix effect 없음, <1이면 suppression, >1이면 enhancement)

3️⃣ IS-normalized MF

내부표준으로 보정된 MF → 실제 영향 평가에 더 유용

이 세 지표는 SPE와 LLE를 비교할 때 가장 중요한 판단 기준이 된다.

 

6. SPE vs LLE: Matrix Effect 비교 실험 (실제 분석 사례)

 

• LLE (MTBE): Recovery 85%, MF = 0.95
• SPE (C18): Recovery 92%, MF = 1.01
• 결론: SPE가 matrix suppression을 완전히 억제, reproducibility 우수

6.2 Case 2️⃣ – 항바이러스제 Candidate B (Polar molecule)

• LLE (Ethyl acetate): Recovery 45%, MF = 0.8
• SPE (HLB): Recovery 88%, MF = 0.97
• 결론: 극성 화합물의 경우 LLE에서 회수율 급감 → SPE 선택 필수

6.3 Case 3️⃣ – CNS drug Candidate C (Basic compound, logP 2.3)

• LLE (MTBE, pH 9): Recovery 80%, MF = 1.1
• SPE (Mixed-mode): Recovery 76%, MF = 0.99
• 결론: 두 방법 모두 우수하나, SPE는 background noise가 낮음

요약하면, LLE는 비극성·중간극성 소분자,
SPE는 극성 또는 구조 복잡한 약물에 유리하다.

7. Matrix effect가 발생하는 메커니즘적 차이

 

구분	LLE	SPE
원리	용매 간 분배	고체 흡착/용출
제거 가능한 matrix	단백질, 염류	단백질, 인지질, endogenous metabolites
Ion suppression 원인	상분리 불완전, 용매 잔류	sorbent carry-over, 용출 불충분
이온화 효율	높으나 재현성 낮음	중간~높음, reproducibility 우수
matrix effect	중간~높음	낮음

즉, SPE는 구조적 선택성이 높고 세척 단계를 통해 인지질과 내인성 간섭을 제거하기 때문에
matrix effect가 가장 낮은 전처리법으로 평가된다.

 

8. 분석 대상 약물의 물리화학적 성질에 따른 선택 가이드

 

특성	권장 전처리법	이유
logP > 3 (비극성 약물)	LLE	유기상으로의 분배 용이
logP 1–3 (중간극성)	LLE 또는 SPE	실험적으로 비교
logP < 1 (극성 약물)	SPE (HLB, Mixed-mode)	회수율 향상
pKa < 5 (산성 약물)	LLE(pH control)	탈이온화 형태로 추출
pKa > 7 (염기성 약물)	SPE (SCX)	이온교환 효과

 

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9. Automation과 throughput 관점에서의 비교

• SPE는 positive pressure manifold, 96-well plate 기반의 고속 자동화 (high-throughput) 구현이 가능하다.
  삼성바이오로직스 등 국내 기업에서도 SPE 자동화 로봇을 도입해 1일 2000샘플 이상 처리하는 사례가 늘고 있다.
• LLE는 여전히 manual step이 많아 automation에 불리하지만,
  단일 성분의 신속한 screening 분석에서는 여전히 가장 효율적이다.

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10. 실험적 최적화 팁

1️⃣ LLE에서의 pH 조절

• 약물의 이온화 상태에 따라 상분배 효율이 크게 달라진다.
• 예: 염기성 약물 → pH 9 buffer, 산성 약물 → pH 3 buffer

2️⃣ SPE에서의 washing 단계 강화

• 5% MeOH + 0.1% FA로 세척 후, 100% MeOH로 elution 시 matrix 잔류 최소화

3️⃣ Elution solvent 완전 건조 후 재용해

• organic solvent 잔류 시 MS signal drift 발생

4️⃣ Internal standard 선택

• 동일 화학적 성질을 가진 stable isotope-labeled IS 필수

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11. 국내 제약사 분석팀 사례

유한양행, GC녹십자 등 국내 주요 제약사는
LC-MS/MS 기반 임상 및 비임상 약물 분석 플랫폼을 구축하면서
전처리 선택에 대한 내부 표준 가이드를 개발하고 있다.

예를 들어,

• 유한양행: 극성 대사체 분석 시 LLE(pH 조정) 후 SPE clean-up 병행
• 종근당: 고감도 항암제 LC-MS/MS 정량에서 dual cleanup (protein precipitation + SPE) 사용

이처럼 실제 산업 현장에서는 SPE와 LLE를 단일법이 아닌 complementary approach로 활용하고 있다.

 

12. 결론 – “한 가지 방법으로 모든 시료를 설명할 수 없다”

SPE와 LLE는 각각의 철학이 다르다.
LLE는 단순성과 효율성을, SPE는 선택성과 일관성을 제공한다.

Matrix effect 최소화와 정확도 확보라는 관점에서 볼 때,

• 극성 화합물 및 장기 reproducibility를 중시한다면 SPE,
• 단순 소분자 고감도 스크리닝이 목적이라면 LLE가 이상적이다.

궁극적으로 중요한 것은 ‘한 가지 방법의 우열’이 아니라,

“Analyte의 화학적 특성과 Matrix의 복잡성을 정확히 이해하고,
그에 맞는 전처리 전략을 설계하는 분석자의 판단력이다.”

 

Solid-phase extraction (SPE) vs. Liquid-liquid extraction (LLE): Matrix Effect 비교 평가 – 분석 정확도 확보를 위한 전처리법 선택 가이드