Internal Standard 선택 전략 – Stable Isotope Labeling의 활용과 한계

LC-MS/MS 정량 분석의 정확도와 재현성을 결정짓는 숨은 변수

Internal Standard 선택 전략 – Stable Isotope Labeling의 활용과 한계

1. 서론 – 내부표준의 존재 이유: “정량의 기준점을 잡는 눈금”

LC-MS/MS 기반 정량 분석에서 internal standard(IS)는 단순히 신호를 나누어주는 보정 인자가 아니다.
IS는 시료 전처리, 이온화, 분리, 검출 전 과정에서 발생하는 변동을 상쇄하는 기준점(reference point)으로 작용한다.

즉, internal standard의 품질과 특성은 분석법 전체의 reproducibility를 결정한다.
동일한 시료라도 matrix가 다르고, 전처리 과정의 손실율이 다르면 raw peak area는 쉽게 흔들린다.
이때 IS는 analyte와 동일한 물리·화학적 거동을 보이며 변동을 보정한다.

💬 “IS는 분석자의 눈금이다. 눈금이 흔들리면, 숫자는 더 이상 신뢰할 수 없다.”

2. Internal Standard의 기본 역할

1️⃣ 시료 전처리 과정의 손실 보정

• Extraction recovery의 편차를 보정
• 특히 protein precipitation, LLE, SPE 과정에서 분석물질의 손실률 보정

2️⃣ 이온화 효율의 변동 보정 (Matrix effect 보정)

• Plasma, urine, tissue 등 matrix-dependent ion suppression 또는 enhancement 보정

3️⃣ Instrumental variation 보정

• Injection volume, spray stability, detector response fluctuation 보정

4️⃣ Calibration curve 정규화(normalization)

• Peak area ratio (Analyte/IS)를 이용해 day-to-day variation 최소화

3. Internal Standard의 종류

 

구분	예시	특징	한계
Structural analog IS	비슷한 화학구조의 유사체	합성 용이, 저비용	Extraction/ionization behavior 상이
Stable isotope-labeled IS (SIL-IS)	^2H, ^13C, ^15N, ^18O 등 동위원소 표지 화합물	Analyte와 동일한 화학적 거동	비싸고, availability 제한
Surrogate IS	구조적으로 유사하지만 전혀 다른 물질	Class-specific quantitation 가능	정확도 낮음
Endogenous IS (내인성 대사체)	Creatinine, cholesterol 등	내부 기준으로 사용 가능	matrix variability 존재

이 중 Stable Isotope-Labeled IS(SIL-IS)가 정량 분석의 ‘gold standard’로 간주된다.
왜냐하면 analyte와 동일한 화학 구조를 가지므로,
모든 단계에서 거의 동일한 물리적 거동을 보이기 때문이다.

4. Stable Isotope-Labeled Internal Standard(SIL-IS)의 원리

SIL-IS는 분석 대상 화합물(analyte)에 **동위원소(^2H, ^13C, ^15N 등)**를 도입하여
질량(Mass-to-Charge, m/z)이 약간 차이나게 만든 물질이다.

예를 들어, caffeine-d3은 caffeine과 구조는 동일하지만
수소 3개가 중수소로 치환되어 m/z가 +3 증가한다.
따라서 LC 분리 및 이온화 과정에서는 동일하게 움직이지만,
MS/MS에서 분리되어 독립적으로 검출된다.

즉, 물리·화학적 거동은 동일하고, 질량만 다르다.

이 특성 덕분에 SIL-IS는

• 전처리 손실률
• matrix suppression
• spray fluctuation
  등의 영향을 완벽히 보정할 수 있다.

5. SIL-IS 설계 시 고려사항

5.1 동위원소 표지 원자의 종류

동위원소	Mass shift (Da)	안정성	비용	특징
^2H (Deuterium)	+1 per H	낮음 (exchange 가능)	저렴	가장 흔함, 교환 가능성 존재
^13C	+1 per C	매우 안정	높음	가장 신뢰성 높음
^15N	+1 per N	안정	중간	질소 함유 화합물에 적합
^18O	+2 per O	불안정 (exchange 가능)	높음	희귀 사용

→ 따라서 LC-MS/MS 정량에서는 ^13C 또는 ^15N 표지 IS가 선호된다.
^2H 표지 IS는 종종 용매 내 exchange 반응으로 signal drift를 일으킨다.

5.2 Labeling 위치의 중요성

Labeling은 반드시 MS/MS에서 선택된 fragment ion에 남아야 한다.
즉, 만약 동위원소가 fragment 과정에서 떨어져 나가면
analyte와 동일한 m/z fragment를 형성하여 보정이 불가능하다.

✅ Fragmentation stability 확인:
MS/MS spectrum에서 precursor 및 product ion 모두 mass difference 유지 여부 검증 필수.

5.3 Label 수량과 isotopic purity

Label 수가 적으면 (예: d2, d3), analyte 신호와 중첩(overlap) 가능성이 있다.
따라서 mass difference ≥ 3 Da, isotopic purity ≥ 99%가 권장된다.

6. SIL-IS 활용 시 장점

1️⃣ Matrix effect 보정에 탁월
→ 동일한 chromatographic 및 ionization 환경에서 signal ratio 안정

2️⃣ Extraction recovery 차이 상쇄
→ LLE, SPE 등에서 발생하는 손실률 차이 보정

3️⃣ 시스템 변동성 보정 (Injection volume drift 등)

4️⃣ Long-term reproducibility 확보
→ 장기 분석(batch 분석) 시 analyte/IS 비율의 안정성 유지

7. 그러나 완벽하지 않다 – Stable isotope labeling의 한계

7.1 Isotopic exchange 문제 (특히 ^2H-labeled IS)

Deuterium(^2H) 표지는 용매의 protic 성분(H₂O, MeOH 등)과 교환 반응을 일으킨다.
특히 hydroxyl (-OH), amine (-NH) 부위에 결합된 deuterium은 쉽게 교환되어
시간이 지날수록 mass shift가 감소하거나 신호가 변동한다.

→ 결과적으로 long-term stability 및 batch 간 reproducibility 저하

7.2 Chromatographic separation 미세 차이

동위원소 치환은 분자 극성(polarity)과 hydrophobicity를 약간 변화시킨다.
그 결과 analyte와 SIL-IS가 완전히 동일한 RT(retention time)를 보이지 않고
0.01–0.05분 정도 shift되는 경우가 있다.

특히 fast gradient나 narrow peak에서 이 차이는 정량 오차로 이어질 수 있다.

7.3 Isotopic impurity

Labeling 과정에서 미표지(non-labeled) 물질이 1–5% 섞이는 경우가 있다.
이 impurity는 analyte의 native ion channel에 신호를 더해
low QC에서 background noise 증가를 초래할 수 있다.

7.4 가격과 확보의 어려움

특히 신약 후보물질이나 희귀 대사체는 stable isotope IS가 시판되지 않는다.
이 경우 자체 합성이 필요하지만,

• 합성 비용 (약 1,000–5,000 USD 이상)
• 합성 기간 (3–6개월)
• 합성 후 순도 검증
  등이 추가된다.

국내 제약사의 경우 SIL-IS 확보 어려움이 method 개발 timeline의 주요 병목이 된다.

8. Matrix effect 보정의 실제 비교

 

IS 종류	Matrix effect (% difference vs solvent)	정량 reproducibility (CV%)
None	30–50%	>15%
Structural analog IS	10–25%	8–12%
SIL-IS	<5%	<5%

한미약품 분석본부의 실제 사례에서도,
cancer drug metabolite quantitation에서 SIL-IS 사용 시
matrix effect correction이 95% 이상 일관되게 이루어졌으며,
batch-to-batch CV가 3.8%로 감소했다.

 

9. 실무 적용 전략 – “IS는 선택이 아니라 설계다”

9.1 Labeling이 불가능한 경우의 대안

• Structural analog IS 선택 시 유사한 logP, pKa, retention time 확보
• Class-specific IS 적용: 예) benzodiazepine류 공통 IS 사용

9.2 Custom synthesis 시 고려사항

• Fragmentation path 내에 label 유지
• 3 Da 이상 mass shift 확보
• Deuterium labeling 지양, ^13C 또는 ^15N labeling 선호

9.3 Long-term stability 관리

• SIL-IS stock 용액은 -80°C 보관, light-protection
• 3개월 단위로 purity 및 isotopic integrity 재검증
• Solvent에 D₂O 1% 첨가로 exchange 억제

10. 국내외 사례 비교

구분	사례	주요 특징
유한양행	SIL-IS 합성 외주화 (Cambridge Isotope)	Early phase metabolic study에 활용
Pfizer (미국)	Oncology pipeline에서 multi-analyte SIL-IS mixture 적용	Combination therapy quantitation에서 reproducibility 강화
AstraZeneca (UK)	Stable isotope tracing & quantitation 병행	Metabolite flux + quantitation 동시 추적
Roche (스위스)	ADC catabolite LC-MS/MS quantitation에 ^13C₆-IS 사용	Peptide-based IS 활용

11. 향후 전망 – Isotopically labeled internal standard의 진화 방향

1️⃣ Universal SIL-mix library 구축
– 표준화된 class-specific IS mixture 제공 (예: lipidomics, metabolomics 용)

2️⃣ Non-radioactive synthetic automation
– AI-driven synthesis planning을 통한 IS 제작 기간 단축

3️⃣ Isotopic artificial intelligence (AI-IS) selection
– AI가 fragmentation path 및 labeling site를 예측하여 최적화

4️⃣ Hybrid internal standard concept
– SIL-IS + AI normalization을 결합한 next-generation correction model

12. 결론 – “정량의 신뢰도는 IS에서 완성된다”

Stable isotope-labeled internal standard는 LC-MS/MS 정량 분석에서
정확도의 마지막 보루(last line of defense)이다.
Matrix effect, recovery variation, instrumental drift 등
수많은 불확실성을 한 번에 잡아주는 가장 강력한 품질 보정 수단이다.

그러나 완벽하지 않다.
Deuterium exchange, chromatographic shift, labeling 비용 등
현실적인 제약이 존재한다.
따라서 분석팀은 단순히 “SIL-IS를 썼다”가 아니라
“어떤 원자, 어떤 위치, 어떤 fragment에 남아 있는가”를 과학적으로 설계해야 한다.

Internal standard는 선택이 아니라, 분석철학이다.