High Matrix Biological Sample에서의 Ion Suppression 원인 분석 및 보정 기법

― LC-MS/MS 정량 분석에서 “보이지 않는 손실”을 과학적으로 제어하기

1. 서론 – 높은 매트릭스 복잡도 속 감도 저하의 딜레마

LC-MS/MS 분석에서 가장 자주 듣는 말 중 하나는 “signal이 안 올라간다”일 것이다.
특히 혈장, 소변, 조직 균질물(tissue homogenate)과 같은 high matrix biological sample에서는
동일한 농도의 분석물질(analyte)을 주입해도 signal intensity가 절반 이하로 감소하는 경우가 흔하다.

이 현상의 주된 원인이 바로 ion suppression이다.
Ion suppression은 LC로 분리된 시료가 ESI (Electrospray Ionization) 또는 APCI 소스를 거칠 때,
시료 내 공존물질(matrix component)이 분석물질의 이온화를 방해하는 현상이다.

즉, “분석물질의 양은 그대로인데, 전하를 얻지 못해 검출되지 않는 것”이다.

2. Ion Suppression의 물리화학적 원리

2.1 ESI(전자분무이온화) 과정의 핵심

ESI 소스에서 분석물질은 미세한 액적(droplet) 상태로 분무되고,
증발과 함께 전하가 집중되며 “Coulomb explosion”을 통해 이온이 기체상으로 전이된다.

이때 droplet 내부에는 수천~수만 개의 분자가 존재하며,
이들 중 누가 전하를 차지할지는 표면활성, 용해도, 휘발성, 극성 등에 의해 결정된다.

즉, droplet 안에서

• 인지질(phospholipid),
• 염(salt),
• 단백질 잔류물,
• 내인성 대사체(endogenous metabolite) 등이
  analyte보다 먼저 전하를 차지하면, analyte의 이온화 효율이 급격히 떨어진다.

이것이 바로 ion suppression의 근본적 메커니즘이다.

3. Biological Matrix의 복잡성과 suppression hotspot

혈장이나 조직 추출물에서는 suppression이 특정 시간대에 집중적으로 발생한다.
이 구간을 suppression hotspot이라 부르며, LC gradient 상에서 보통
초기 1~2분 또는 용리 기울기 변화 구간(40–70% organic)에서 관찰된다.

3.1 주요 suppression 유발 인자

 

Matrix Component	주요 화합물 예시	suppression mechanism
Phospholipids	lysophosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine 등	droplet 표면에 강하게 흡착 → 전하 경쟁
Salts (Na⁺, K⁺, Cl⁻)	physiological saline, buffer residue	charge competition, adduct formation
Proteins / Peptides	albumin, globulin	droplet viscosity 증가, desolvation 방해
Endogenous metabolites	bile acid, fatty acid	ionization 효율 감소
Surfactants (formulation)	polysorbate 80, SDS 등	spray stability 저하

이 중 phospholipid는 가장 강력한 suppression 유발 인자다.
실제 plasma 시료를 LC-ESI-MS/MS로 분석하면,
lysophosphatidylcholine (m/z 184.1) 신호가 analyte의 retention time 인근에서 peak 형태로 나타나는 경우가 많다.
이는 co-elution된 인지질이 이온화 경쟁을 일으키고 있다는 명확한 지표다.

4. Ion Suppression 진단 방법

Ion suppression은 단순히 “감도가 낮다”로 확인할 수 있는 현상이 아니다.
따라서 이를 정량적으로 평가하기 위한 실험적 접근이 필요하다.

4.1 Post-column infusion test

이 방법은 LC column 후단에서 analyte를 지속적으로 일정 농도로 주입하면서,
blank matrix를 주입했을 때의 signal drop 구간을 시각화하는 것이다.

• Suppression이 일어나는 구간에서는 analyte signal이 일시적으로 감소
• Chromatogram 상에서 suppression region을 직접 확인 가능
• LC gradient 조건 최적화의 기준으로 활용

예시:
혈장 matrix를 주입했을 때 2.3~2.6 min 구간에서 signal dip이 나타난다면,
이는 해당 시간대에 elute되는 인지질 군이 suppression을 유발하고 있음을 의미한다.

5. Ion Suppression 최소화 전략

5.1 전처리(Extraction) 단계에서의 완화

(1) Protein precipitation (PPT) 후 phospholipid 제거

• Methanol이나 acetonitrile을 사용한 단순 PPT로는 인지질 제거 한계
• 추가적으로 phospholipid removal cartridge (Hybrid-SPE, Ostro 등) 사용 시 suppression 약 60~80% 감소

(2) Liquid-Liquid Extraction (LLE)

• 비극성 용매 (MTBE, ethyl acetate)로 인지질 제거 가능
• 단, 회수율(recovery) 손실 우려 → analyte 극성 고려

(3) Solid-Phase Extraction (SPE)

• Mixed-mode cation/anion exchange 카트리지 사용 시
  염, 인지질, 펩타이드 등 동시 제거 가능
• SPE elution 조건은 analyte의 pKa, logP에 맞게 설정

(4) Hybrid 방법 (PPT + phospholipid removal)

• 실무적으로 가장 많이 쓰이는 방법
• 간단하면서도 reproducibility 우수

5.2 Chromatographic 분리 조건 조정

(1) Column selection

• C18에서 인지질과 analyte가 co-elute된다면
  → C8, Phenyl-Hexyl, Biphenyl 등으로 변경
• 인지질은 tailing이 심하기 때문에 stationary phase interaction 차이를 활용

(2) Gradient optimization

• Early eluting compound suppression 시 → initial hold를 연장
• Late eluting compound suppression 시 → organic ramp 완만화

(3) Mobile phase modifier

• 0.1% formic acid 대신 ammonium formate (2–5 mM) buffer 사용 시
  ionization balance 개선 사례 다수 보고됨
• buffer 종류에 따라 adduct ion (Na⁺, K⁺) 형성도 감소

6. Ionization efficiency 개선을 위한 Source Parameter 조정

• IonSpray Voltage: 너무 낮으면 droplet charge 부족, 너무 높으면 discharge 발생
• Source Temp: desolvation 속도 향상으로 suppression 완화
• Nebulizer / Auxiliary Gas: droplet 분무와 증발 균형 유지
• Curtain Gas: neutral contaminant 제거

보통 matrix가 복잡할수록 source temperature와 GS2(보조 가스)를 높여
droplet 건조를 촉진하는 것이 suppression 완화에 효과적이다.

7. Internal Standard (IS) 보정 전략

Ion suppression의 영향을 제거하기 위해 가장 보편적인 접근은
Stable isotope-labeled internal standard (SIL-IS)를 사용하는 것이다.

SIL-IS는 analyte와 화학적으로 거의 동일하기 때문에
matrix-induced suppression이 동일하게 작용한다.
따라서 suppression이 발생하더라도 analyte/IS ratio는 일정하게 유지되어
정량 정확도를 보장할 수 있다.

단, 완벽한 보정이 되기 위해서는 co-elution이 반드시 확보되어야 한다.
Retention time이 조금이라도 어긋나면 suppression 영역이 다르게 작용해 오차가 발생한다.

💡 특히 혈장 분석에서는 d₃, ¹³C₆ labeling 등 heavy isotope-labeled analog를 사용해야 하며,
구조 유사체(analog IS)는 matrix effect를 완전히 상쇄하지 못한다.

 

8. LC-MS/MS 기기 세팅 단계에서의 suppression 모니터링

실험실에서는 batch별 matrix effect를 아래와 같이 주기적으로 모니터링하는 것이 좋다.

 

QC 구분	목적	측정 방법
Matrix factor (MF)	suppression 정도 평가	MF = (peak area in matrix / peak area in solvent)
IS-normalized MF	IS 보정 후 suppression 확인	MF(IS) = MF(analyte) / MF(IS)
Acceptance criterion	CV ≤ 15%	6개 donor matrix로 검증

이 평가는 Bioanalytical Method Validation (BMV) 가이드라인(FDA, EMA)에서도
정식으로 요구되는 절차이다.

9. Case Study – 항암제 혈장 분석에서의 suppression 개선 사례

항암제 A (kinase inhibitor)의 혈장 내 정량에서
initial method로 감도가 낮아 LLOQ 5 ng/mL 이하에서 변동이 컸다.

Post-column infusion test 결과, RT 3.1분 부근에서 phospholipid signal (m/z 184.1)이 analyte peak와 중첩되어 suppression이 확인되었다.

조치 결과:

 

조치 단계	내용	결과
① PPT → Hybrid-SPE 전처리로 변경	phospholipid 제거율 75%	baseline noise 감소
② Column을 C18 → Biphenyl로 변경	RT 3.1 → 4.5분으로 이동	co-elution 해소
③ Source Temp 450 → 550°C	desolvation 개선	S/N ratio +60%
④ SIL-IS 추가 (¹³C₆-labeled analyte)	IS-normalized MF 안정화	CV 6.5% 달성
최종 결과	–	LLOQ 1 ng/mL 확보, reproducibility ±10% 내

 

10. 고급 보정 기법 – Machine Learning 기반 Matrix Effect 예측

최근에는 LC-MS/MS 데이터의 retention time, peak shape, intensity pattern을 활용해
AI 모델이 suppression risk를 예측하는 연구가 활발하다.

예를 들어, 각 compound의 physicochemical descriptor (logP, pKa, RT, polarity index)를 feature로 사용해
matrix-dependent suppression zone을 사전 예측하고,
gradient 설계 단계에서 이를 회피하는 “predictive chromatographic planning” 기법이 시도되고 있다.

국내 제약사에서도 이러한 AI 기반 자동 tuning 알고리즘을
method development 단계에 도입하는 추세다.

11. 결론 – suppression은 피할 수 없지만, 제어할 수 있다

Ion suppression은 LC-MS/MS 정량 분석의 영원한 과제이지만,
그 발생 메커니즘을 이해하고, 전처리·LC 분리·이온화 조건을 체계적으로 최적화하면
그 영향을 최소화할 수 있다.

결국 suppression은 물리적 현상이 아니라, 관리의 문제다.
분석팀의 경험과 데이터 기반 접근이 쌓일수록,
“보이지 않던 신호”는 점점 선명해진다.

“감도를 잃는 순간을 관찰하고, 그 순간을 설계로 되돌리는 것 —
이것이 숙련된 분석가의 진짜 기술이다.”

High Matrix Biological Sample에서의 Ion Suppression 원인 분석 및 보정 기법