Stability-Indicating Method 개발 – ICH Q1A 기반 분해산물 및 Unknown Impurity 분석 사례

Stability-Indicating Method 개발 – ICH Q1A 기반 분해산물 및 Unknown Impurity 분석 사례

의약품 개발 과정에서 “품질”이라는 단어가 갖는 의미는 꽤 단단하다. 함량이 기준에 맞는지, 순도가 허용 범위 안에 있는지, 불순물이나 분해산물이 얼마나 발생했는지 같은 정보들은 단순한 데이터 목록이 아니라, 약물이 환자의 몸속에서 보여줄 미래의 모습을 예측하는 중요한 단서다. 제조 공정의 작은 흔들림, 원료의 경미한 차이, 혹은 저장 환경의 변화 같은 것들이 약물의 안정성에 얼마나 큰 영향을 미치는지를 우리는 여러 차례 경험해 왔다.

그래서 신약이든 제네릭이든, 어느 단계의 품목이든 결국 “Stability-indicating method(SIM) 개발”은 피해 갈 수 없는 핵심 과제다. ICH Q1A(R2) 가이드라인이 강조하는 것도 같은 맥락이다. 시간의 흐름과 환경 변화 속에서 실제로 약물이 어떻게 분해되고, 어떤 형태의 unknown impurity가 나타나는지를 체계적으로 확인할 수 있는 정량·정성 방법을 확보하는 것이 품질 보호의 출발점이기 때문이다.

이 글에서는 실제 분석자가 SIM을 구축하는 과정에서 고려해야 할 핵심 요소들을 LC-MS/MS 중심으로 풀어보고, 제약 현장에서 자주 마주치는 분해산물 사례와 unknown peak 조사 전략까지 함께 정리해 보았다. 

1. Stability-Indicating Method란 무엇인가 – ICH Q1A의 핵심 요구

ICH Q1A(R2)는 의약품의 장기·가속 안정성 시험을 어떻게 설계하고 수행해야 하는지 제시하는 국제 가이드라인이다. 이 안에서 SIM은 다음과 같은 요건을 충족해야 한다.

✔ 1) 약물 자체(active moiety)를 명확하게 분리할 것

원료약(API)과 완제 제형(dosage form) 모두에서, 약물이 어떤 형태로 존재하는지 명확히 분리·정량할 수 있어야 한다.

✔ 2) 생성 가능한 분해산물을 충분히 분리할 것

열, 빛, 습도, pH 변화, 산화 환경 등에서 발생하는 모든 potential degradation product를 분리할 능력이 필요하다.

✔ 3) 불순물(known & unknown impurity)을 분해산물과 함께 구분할 것

계량적 분리(peak purity), 정성적 분석(fragmentation pattern), retention behavior 등을 통해 겹쳐진 peak를 구분할 수 있어야 한다.

✔ 4) 실제 안정성 시험에서 관찰되는 변화와 일관될 것

실제 3개월/6개월/12개월 조건에서 등장하는 문제를 설명할 수 있어야 하며, forced degradation study 결과와 논리적으로 연결되어야 한다.

즉, SIM 개발은 HPLC 혹은 LC-MS로 “깔끔한 분리 조건을 찾는 작업”이 아니다.
약물의 분해 메커니즘 자체를 이해하는 과정에 가깝다.

2. Forced Degradation Study – SIM의 출발점

Stability-indicating method를 설계할 때 가장 먼저 수행하는 것이 **Forced degradation study(FDS)**다. FDS는 약물을 극단적인 환경에 노출해 분해 반응을 강제로 일으켜 보는 실험으로, 다음 6가지 조건이 표준적으로 사용된다.

• 산 조건(HCl)
• 염기 조건(NaOH)
• 산화 조건(H₂O₂)
• 열 조건
• 광 조건(Photolysis)
• 습도 조건

대부분의 약물은 이 중 2~4가지 조건에서 특징적인 분해 패턴을 보여준다. 예를 들어, 아미드 결합을 포함한 많은 항암제는 산·염기 조건 모두에서 빠르게 가수분해되며, 아민 기반 분자들은 H₂O₂ 조건에서 산화 분해가 선행된다. 반대로 hydrophobic small molecule들은 열·광 조건에서 더 큰 변화를 보이기도 한다.

■ FDS가 중요한 이유

약물이 실제 저장 조건에서 보여줄 분해 양상은 매우 천천히 나타난다. 따라서 SIM이 제 역할을 하려면 “어떤 분해산물이 어떤 환경에서 주로 만들어지는지”를 미리 알아야 한다.

즉, FDS는 약물의 분해 경로(degradation pathway) 지도를 미리 그리는 작업이다.

3. LC Method 개발의 실제 – Column, Mobile Phase, Gradient

SIM을 구축할 때 가장 큰 실수 중 하나는 “분해산물은 어차피 retention이 다르겠지”라는 막연한 전제다. 그러나 실제 분해산물 분석에서는 API peak 바로 옆에 위치하거나, tailing이 심한 fragment peak와 겹치는 경우가 반복적으로 나타난다.

따라서 첫 단계에서는 일반적인 HPLC가 아니라, peak purity 분석이 가능한 UV-DAD + LC-MS 조건을 동시에 고려해야 한다.

■ 1) Column 선택 전략

분해산물은 API보다 극성이 크거나 작을 수 있고, 구조적 변형 정도에 따라 분리 난이도가 크게 달라진다.

따라서 초기에 최소 3종 이상의 컬럼을 비교하는 것이 좋다.

• C18 (기본)
• Phenyl-hexyl (aromaticity 관련 분해산물 분리에 유리)
• HILIC column (고극성 분해산물 분리용)

특히 nitro-aromatic 계열 API는 phenyl 컬럼에서 peak shape이 현저히 개선되는 경우가 많다.

■ 2) 모바일 페이즈 선택

분해산물은 API에 비해 ionization efficiency가 크게 다르다. LC-MS에서 일반적으로 사용되는 조건은 다음과 같다.

• A: 0.1% formic acid in water
• B: ACN 혹은 MeOH
• pH 조절이 필요한 경우 ammonium acetate buffer 추가

분해산물 중 acidic fragment는 pH 4.0~5.0 조건에서 peak shape가 개선되는 경우가 있어, 단순 acid additive만 사용할지, buffer를 도입할지 검토해야 한다.

■ 3) Gradient design

SIM은 API peak만 잘 나오면 끝나는 분석이 아니기 때문에, gradients는 다음 기준을 따라야 한다.

1. early eluting hydrophilic DP 분리
2. main peak 근처의 tight spacing peak resolution 확보
3. late-eluting lipophilic impurity 제거

그래서 종종 두 단계 gradient를 사용한다:

• 초반 완만한 gradient (0–20%) → early DP 구분
• 중반–후반 steep gradient (20–90%) → hydrophobic impurity 제거

4. LC-MS/MS를 활용한 분해산물 구조 추론 Workflow

SIM의 핵심은 분해산물을 정확히 “보는 것”이 아니라, “정의하는 것”이다. LC-MS/MS는 구조 규명 과정에서 가장 강력한 기능을 제공한다.

다음은 실제 구조 동정 workflow의 단계다.

① 정확한 mass 측정 (HR-MS)

High-resolution MS(Exactive, QTOF 등)를 사용하면 분해산물의 정확한 분자량을 결정할 수 있다.
예: m/z 456.2134 → C₂₁H₃₀N₄O₅ 의 분자식 후보.

여기서 isotopic pattern을 비교하면 Cl, Br, S 등 hetero atom 포함 여부도 추정 가능하다.

② Fragmentation pattern 분석

MS/MS를 통해 어떤 결합이 끊어졌는지 확인한다.

예를 들어, API의 amide bond가 분해되어 두 개의 fragment로 나뉜 경우, MS/MS 스펙트럼은 다음 신호를 보여준다.

• API: m/z 515
• DP1: m/z 286
• DP2: m/z 230

이 패턴은 API 구조의 어떤 부분이 약한 결합인지 알려준다.

③ 분해 조건과 fragment 비교

산 조건, 염기 조건, 산화 조건에서 공통적으로 나타나는 분해산물은 “가장 취약한 구조 단위”로 판단할 수 있다.

예:

• 산·염기 공통 → amide cleavage
• 산화 조건에서만 생성 → tertiary amine oxidation
• 광 조건에서만 생성 → aromatic ring photolysis

조건 간 생성량 차이는 “분해 메커니즘”을 추론하는 데 중요하다.

④ retention time behavior 분석

극성이 증가한 분해산물은 일반적으로 RT가 짧아지고, hydrophobic fragment는 RT가 길어진다.

예를 들어, methoxy group이 hydroxyl으로 변환된 분해산물은 RT가 일반적으로 1–2분 앞당겨진다.

⑤ Authentic standard 비교 (가능한 경우)

일부 핵심 분해산물은 실제 reference standard를 구입하거나 반합성으로 제작해 비교한다.

하지만 대부분의 unknown DP는 authentic standard 없이도 LC-MS/MS만으로 구조를 비교적 정확히 추정할 수 있다.

5. Unknown impurity 조사 – 실무자의 실제 Workflow

실제로 SIM 개발 과정에서 가장 어려운 단계는 unknown impurity 분석이다. 이 과정은 단순히 mass만 얻으면 끝나는 문제가 아니라, 다음과 같은 절차를 통해 정보가 쌓여야 한다.

① unknown peak 검출

UV-DAD 기준 peak purity가 낮거나, LC-MS에서 새로운 ion이 검출되면 해당 peak를 후보로 지정한다.

② LC-MS full scan & MS/MS acquisition

특히 Q1 scan과 product ion scan을 모두 수행해 neutral loss 패턴을 확인한다.
Neutral loss는 구조 동정에 매우 강력한 힌트를 준다.

예:

• neutral loss of 18 Da → dehydration
• neutral loss of 44 Da → CO₂ loss
• neutral loss of 31 Da → OCH₃ loss

③ CID energy를 여러 단계로 조절

low collision energy에서는 parent-like fragment가 많이 나오고,
high energy에서는 deeper fragmentation 패턴이 나타난다.

이 둘을 비교하면 가능 구조의 범위가 좁아진다.

④ 예측 분해 경로와 연계

FDS 결과와 unknown peak의 fragmentation pattern이 일치하면, 해당 impurity의 생성 경로를 도출할 수 있다.

예:

• 산화 조건에서만 나타난 unknown → amine oxidation 가능성
• base 조건에서 증가한 unknown → ester/amide cleavage 이후 secondary rearrangement

⑤ Rt-MS/MS matching을 기반으로 구조 후보 선정

최종 보고할 때는 다음 두 요소가 필수다.

1. Rt shift 경향
2. MS/MS fragment 일치성

이 두 가지가 모두 충족되어야 impurity identity를 “tentative identification” 수준으로 보고할 수 있다.

6. 실제 사례 – 국내 제약사의 SIM 구축 과정

실제 한미약품을 비롯한 국내 여러 제약사는 global 수준의 SIM을 구축해 국제 허가 기관의 요구를 충족하고 있다. 아래 사례는 공통적으로 등장하는 패턴을 정리한 것이다.

■ 사례 1. 산 조건에서 빠르게 생기는 hydrolysis DP

• API가 amide 기반 구조일 때 빈번
• DP가 UV chromophore를 공유하는 경우 peak 분리가 어려움
• HILIC에서 오히려 분리가 더 잘 된 사례 존재

교훈: SIM 초기에는 reversed-phase C18에만 집착하지 말 것.

■ 사례 2. 산화 조건에서만 등장하는 tertiary amine N-oxide

• RT가 API보다 1.5–2분 앞
• 정확한 mass에서 +16 Da 증가
• MS/MS에서 M→M-17 fragment 잘 나타남

교훈: 산화 DP는 SIM에서 반드시 초기 단계에서 염두에 두어야 한다.

■ 사례 3. 광 조건에서 aromatic ring cleavage

• UV 흡광이 크게 변화
• LC-MS에서 다수의 low-mass fragment 발생
• peak purity가 낮아 2D-LC 혹은 trapping 사용

교훈: API가 광에 약한 경우, SIM은 LC 조건 최적화 그 이상의 일을 요구한다.

■ 사례 4. unknown impurity가 특정 원료 로트에서만 증가

• LC-MS에서 sulfur-containing fragment 확인
• 원료 합성 route 상의 side-reaction 추적
• 원료 벤더 교체로 문제 해결

교훈: unknown impurity는 종종 “API 자체의 분해산물”이 아니라 “공정 잔류물”이다.

7. SIM 밸리데이션 – ICH 가이드라인 부합성 평가

SIM은 품질 시험의 핵심이므로 Validation 요구 수준이 매우 높다.

✔ 필수 평가 항목

• specificity
• accuracy
• precision
• linearity
• LOQ/LLOD
• robustness
• solution stability
• filter compatibility

특히 filter binding은 분해산물 분석에서 자주 놓치는 요소다.
극성이 높은 fragment는 PVDF·Nylon 필터에서 흡착되는 사례가 흔하다.

8. SIM 개발 시 자주 발생하는 문제 & 해결 전략

문제 ① API peak과 DP peak가 분리되지 않음

→ gradient 앞부분을 완만하게 조정
→ ligand density가 높은 C18 컬럼 사용
→ phenyl-hexyl 컬럼 비교

문제 ② MS에서 ionization이 매우 약해 detection limit이 떨어짐

→ mobile phase modifier 최적화
→ MeOH → ACN 전환
→ APCI ion source 비교 (특히 지용성 API)

문제 ③ unknown peak이 batch마다 등장하거나 사라짐

→ reference standard의 degradation 여부 확인
→ sample preparation stability 점검
→ autosampler에 장시간 적재 시 발생 가능성 검토

문제 ④ DP와 IS가 co-elution하여 정량 신호가 왜곡됨

→ IS 변경 필요
→ DP 용량이 많으면 IS peak area suppression 발생
→ RT shift 시 repeatedly injection으로 안정화

9. 최종 정리 – SIM은 단순한 분석법 개발이 아니다

Stability-indicating method(SIM) 개발은 사실상 “약물의 운명”을 해석하는 작업이다.
약물이 시간이 흐르며 어떤 변화 양상을 보이는지, 어떤 환경에서 가장 취약한지, 그리고 어떤 unknown impurity가 안전성과 품질에 영향을 줄 수 있는지를 파악하는 과정이기 때문이다.

특히 LC-MS/MS 기반 SIM은 다음 세 가지 단계를 성공적으로 수행할 때 완성된다.

1. 분해산물 생성 경로의 이해 (forced degradation)
2. 분리·정량 능력을 확보한 LC method 개발
3. LC-MS/MS로 unknown 구조를 명확히 추적하는 정성 분석 능력

국내 제약사들도 ICH Q1A 수준의 SIM을 구축하며, 해외 허가 리뷰에서도 충분한 신뢰성을 인정받고 있다. 개발 초기 단계에서 SIM을 제대로 설계해 두면, scale-up 공정, 상온 안정성, 장기 보관, 유통 조건 등 전 과정에서 품질 위험을 미리 예측할 수 있다.

결국 SIM은 “문제가 생기면 해결하는 분석법”이 아니라
“문제가 생기기 전에 미리 알려주는 분석법”이다.

이 글이 SIM 구축을 준비하는 연구자와 분석 실무자들에게
현장의 경험과 방향성을 제공하는 도움이 되기를 바란다.