Ex vivo Tissue Metabolomics로 약물 침투(Local Distribution) 평가하기

신약 개발 과정에서는 후보물질이 체내에서 “어디까지”, “어떤 형태로”, “얼마나 깊게” 전달되는지 파악하는 일이 매우 중요하다. 특히 표적 장기(target organ)나 병변(tumor tissue) 중심의 치료제라면, 혈중 농도만으로는 답을 얻을 수 없다. 즉, 조직 수준(tissue-level) 에서 약물이 실제로 존재하는지, 분포가 균일한지, 특정 부위에서 축적되거나 빠르게 제거되는지, 또는 대사체 형태로 존재하는지 등을 더 깊게 들여다봐야 한다.

이때 강력한 도구가 바로 Ex vivo tissue metabolomics 이다.

이 글에서는 제약사 분석팀 시각에서

• Ex vivo tissue metabolomics가 왜 중요한지
• 어떻게 준비하고 분석하는지
• LC-MS/MS 기반 workflow
• 약물 침투(local distribution)를 어떻게 정량적으로 해석하는지
• 국내 제약사 vs 해외 사례 비교
  까지 모두 정리해보려 한다.

1. Ex vivo Tissue Metabolomics란 무엇인가?

말 그대로 생체 외에서 확보한 조직(ex vivo tissue) 을 기반으로, 해당 조직 안의

• 약물(parent)
• 대사체(metabolites)
• 내인성 대사체(endogenous metabolites)
  를 “메타볼로믹스 관점”에서 한 번에 분석하는 방법이다.

즉, 약물-대사체-내인성 대사체의 변화를 통합적으로 볼 수 있어 다음과 같은 질문에 답할 수 있다.

1. 약물이 조직 깊숙이 침투했는가?
2. 침투한 약물은 활성형 그대로인가, 대사체 형태인가?
3. 조직 내 대사 환경이 약물 분포에 어떤 영향을 미치는가?
4. 특정 미세환경(microenvironment)이 약물의 국소 농도를 바꾸는가?
5. 조직 내 대사 프로파일 변화가 기전(MoA)과 일치하는가?

그래서 항암제, 항염증제, CNS drug, ADC 등에서 뛰어난 활용도가 있다.

2. 왜 Local Distribution 평가가 중요한가?

특히 다음 분야에서 결정적이다.

① 항암제 (Anti-cancer drug)

종양은 혈류 공급이 불균일하고, 내부는 hypoxia 상태인 경우가 많다.
따라서 혈중 농도가 높아도 종양 핵심(core)에는 약물이 도달하지 못하는 경우가 빈번하다.

예:

• 종양 주변(periphery)에는 농도가 높지만
• 종양 중심(core)에는 농도가 거의 없는 경우 → 약효 실패

② CNS 약물

BBB(Blood–Brain Barrier) 때문에 혈장 농도만 보고 CNS 도달 여부를 판단할 수 없다.
실제 뇌 조직에서의 농도가 약효를 결정한다.

③ 항염증·면역조절제

국소 염증 부위나 조직 침윤 부위에서 약물 농도가 얼마나 유지되는지 확인해야 한다.

④ ADC・항체 약물

항체가 조직에 침투하는 패턴과 payload가 방출된 위치(local release)까지 알아야 한다.

따라서 조직 내 Local distribution 분석은 신약의 약효·독성·PK 모델링의 핵심 기반이 된다.

3. Ex vivo tissue metabolomics의 전체 Workflow

전체 흐름은 다음과 같이 요약할 수 있다.

1. 조직 획득 (Ex vivo sampling)
2. Homogenization (조직 균질화)
3. Extraction (약물 + 대사체 동시 추출)
4. LC-MS/MS 분석 (Untargeted + Targeted 병행)
5. Feature extraction & annotation (메타볼로믹스 전처리)
6. Tissue penetration 및 local distribution 모델링
7. Biological interpretation

아래부터는 실제 실험적 관점에서 하나씩 살펴보자.

 

4. Tissue Preparation — Sample Prep이 절반

1) Tissue 수집 직후의 Handling

조직은 확보하자마자 빠르게 snap-freezing (liquid nitrogen) 해야 한다.
왜냐하면 내인성 대사체는 수초 수준으로 빠르게 변하기 때문이다.

• Organ harvest → 즉시 frozen (–80°C 보관)
• 가능하면 1분 이내 동결이 이상적

국내 제약사에서는 보통 –80°C 보관을 기본으로 하지만
해외 기관(예: Genentech, Novartis)은 dry ice–ethanol bath를 routine SOP로 사용한다.

2) Homogenization

조직은 cryogenic mill 또는 bead beater를 사용해 균질화한다.

• 가장 많이 쓰는 방식:
  50% MeOH / 50% H2O + internal standard
• 강한 조직(뇌, 간 질환 조직)은 bead를 추가

3) Extraction 방식

약물과 대사체를 동시에 회수해야 하므로 보통은:

• Methanol precipitation
• MTBE-based lipid & aqueous dual extraction
• SPE 추가 정제 (필요 시)

특히 “지방이 많은 조직(brain, adipose)”은 lipid removal을 반드시 고려해야 한다.

5. LC-MS(/MS) 분석 조건 — Tissue metabolomics 최적화 포인트

Tissue metabolomics에서는 약물·대사체·내인성 대사체가 모두 들어오므로
분석 조건 튜닝이 일반 untargeted metabolomics보다 어렵다.

(1) LC 조건

• RP-C18 (약물 + 중간극성 대사체)
• HILIC (극성 대사체·energy metabolism 관련 지표)
• 일반적으로 dual chromatography 또는 batch-split

(2) MS 조건

• High-resolution MS (Orbitrap/QTOF)
• Polarity switching (+/–)
• DDA + stepped CE (약물 구조 파악 용이)
• Full scan + MS/MS 병합 데이터

(3) Targeted MRMs 추가

약물 침투를 정확히 평가하려면 untargeted만으로 부족하다.
따라서 대부분 다음을 병행한다:

• Parent drug
• Phase I metabolites
• Phase II metabolites

이들을 위한 Targeted MRM/SRM panel을 구축해 quantification을 수행한다.

6. 전처리 & Feature Extraction — 조직 내 약물 신호를 찾는 과정

Metabolomics software에서 수행하는 단계는 다음과 같다.

• Peak picking
• Deconvolution
• Alignment
• Feature table 구축
• Blank subtraction
• Tissue-specific noise 제거
• Drug-derived feature 필터링

여기서 핵심은 Drug-derived feature filtering이다.

Drug-related feature를 찾는 방법

1. Parent drug accurate mass ±5 ppm
2. Mass shift (+16, +32, +176 등)
3. MS/MS fragmentation 매칭
4. Tissue dose–response correlation
5. Control vs treated fold-change 비교 (보통 10배 이상)

실무 팁

• 종양 조직은 necrotic area가 많은데, 이 부위는 background noise가 높아 normalization에 신경 써야 한다.
• 뇌 조직은 지질 이온이 강하게 나타나 parent drug peak detection을 덮을 수 있으므로, LC gradient를 길게 잡으면 도움이 된다.

7. Local Distribution 정량 모델링 – 핵심 파트

조직 전체 농도만 보아서는 실제 침투 깊이와 공간적 분포를 알 수 없다.
따라서 다음과 같은 분석들이 필요하다.

① Layered tissue sectioning 방법

조직을 겹(층)으로 잘라낸 후, 각 층을 개별 분석한다.

예:
Tumor tissue를

• Layer 1: outer 0–1 mm
• Layer 2: 1–2 mm
• Layer 3: core
  로 나누어 분석한다.

→ 종양 깊이에 따른 농도 gradient를 얻을 수 있다.
이 방식은 항암제 약물 침투 평가에서 가장 많이 쓰인다.

② Spatial metabolomics (MALDI MSI) 와의 병행

LC-MS 기반의 bulk metabolomics만으로는 공간 정보를 잃는다.
이를 보완하기 위해:

• MALDI-MS imaging
• DESI imaging

을 병행해 spatial 정보를 보강할 수 있다.

국내 제약사는 아직 MALDI-MSI 활용 빈도가 낮지만
해외는 이미 standard tool에 가깝다.

Ex vivo LC-MS metabolomics + MALDI-MSI 조합이
약물 침투(local PK)를 가장 정확히 설명하는 접근법이다.

 

③ Tissue PK Modeling

Local distribution은 아래 모델링으로 최종 정량화할 수 있다.

• Tissue partition coefficient (Kp)
• Unbound fraction in tissue (fu_tissue)
• Depth-wise concentration gradient
• Compartmental modeling (periphery vs core)
• Passive diffusion vs transporter-mediated uptake 구분

특히 Kp 및 fu_tissue는 CNS 약물이나 항암제에서 중요하다.

④ 약물 대사체와의 연결

Tissue 안에서 parent drug 대신 대사체가 높은 경우:

• 대사체가 활성형인지(intrinsic activity)
• 조직 내 효소 발현이 높은 건지
• parent clearance가 너무 빠른 건지

등을 해석할 수 있어 PK/PD 모델링과 직접 연결된다.

8. Ex vivo tissue metabolomics 결과를 어떻게 해석할까?

1) 질환 미세환경과 연결

Ex vivo tissue metabolomics는 단순 농도 비교가 아니라,
조직의 상태를 반영하는 내인성 대사체 신호까지 함께 분석할 수 있다.

예:

• 종양 중심부: lactate↑ (hypoxia), glutamine↑
• 염증 조직: arachidonic acid ↑
• 간 조직: bile acid 분포 변화

이런 패턴과 약물 분포를 함께 보면
“약물이 특정 미세환경에서 침투가 제한되는 이유”를 해석할 수 있다.

2) Local pharmacology

약물이 침투했지만 효과가 적다면

• unbound fraction이 낮은 것인지
• transporter efflux 때문인지
• 조직 pH에 trapping된 것인지
  같은 원인을 추적할 수 있다.

3) Ex vivo 결과 → in vivo 예측

어떤 연구팀은 ex vivo tissue concentration을 이용해
in vivo local exposure를 예측하는 hybrid PK 모델을 구축한다.

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9. 국내 제약사 vs 해외 사례 비교

항목	국내 제약사	해외 제약사
Sample prep	조직 homogenization + MeOH extraction 중심	multi-layer sectioning + lipid partition removal 적극적
LC 방식	C18 + HILIC 병렬 분석 제한적	dual-LC workflow 활용 넓음
Spatial 분석	MALDI-MSI 활용 적음	MSI를 거의 routine하게 사용
PK modeling	bulk tissue concentration 중심	depth-wise concentration + Kp modeling 병행
Data integration	Drug + metabolite 중심	endogenous metabolomics까지 통합

국내는 장비·시간·예산 제약 때문에 LC-MS 기반 bulk metabolomics 중심으로 수행한다.
하지만 신약들이 조직 특이적 치료제 형태로 진화하면서
앞으로 MSI·spatial metabolomics 수요도 빠르게 높아질 것이다.

10. 실무 팁(Analysis Team 관점)

1. 뇌 조직은 반드시 lipid suppression 고려
2. 종양 core area sampling 시 necrotic tissue 제외
3. Internal standard는 parent drug와 물리적 특성이 유사한 compound를 선택
4. Protein-rich tissue는 precipitation 후 반드시 centrifuge를 길게 돌릴 것
5. DDA acquisition 시 stepped CE 적용하면 unknown metabolite 동정률 급증
6. Extraction solvent에 0.1% FA 추가하면 carryover 감소
7. Normalization은 ‘조직 무게 + IS + total ion current’ 혼합 방식이 안정적

11. 마무리하며

Ex vivo tissue metabolomics는 단순히 “조직에서 약물이 검출되었는지”를 확인하는 실험을 넘어서,
약물의 국소 침투(local PK) 와 조직 미세환경의 대사 상태,
그리고 약물-대사체-내인성 메타볼라이트 상관성을 통합적으로 보여주는 강력한 방법이다.

특히 종양·CNS·면역계·대사질환 분야에서
기존 PK 연구의 빈틈을 메우는 필수 도구로 자리 잡고 있다.

향후 국내 제약사에서도

• 조직별 multi-layer metabolomics
• spatial metabolomics
• tissue PK modeling
  이 표준 workflow가 될 가능성이 크다.

Ex vivo Tissue Metabolomics로 약물 침투(Local Distribution) 평가하기