TDM(Therapeutic Drug Monitoring)용 LC-MS/MS 분석법의 표준화 과제

TDM(Therapeutic Drug Monitoring)용 LC-MS/MS 분석법의 표준화 과제

 

Calibration traceability 확보와 Matrix harmonization 전략

임상 약물 치료의 정밀성이 점점 강조되는 시대에 들어서면서, TDM(Therapeutic Drug Monitoring)은 더 이상 제한된 특수 환자군에만 적용되는 분석 기술이 아니다. 항간질제, 면역억제제, 항암제, 항생제 등 치료지수(therapeutic index)가 좁거나 환자 간 약동학 변동성이 큰 약물에서는 TDM이 사실상 치료의 일부라고 해도 과언이 아니다. 실제 임상에서는 동일한 용량을 투여해도 환자마다 혈중 농도가 크게 달라지는 일이 흔하고, 이런 차이가 부작용이나 치료 실패로 이어지는 경우도 적지 않다.

이 때문에 많은 병원과 임상시험 기관, 그리고 제약회사 내 LC-MS/MS 분석팀에서 TDM 분석법 구축에 관심을 보이지만, 막상 여러 기관이 생산한 데이터들을 비교해 보면 수십 퍼센트 가까운 차이를 보이는 불일치 현상이 빈번하게 발생한다. 이 문제는 단순히 실험자의 숙련도 차이나 장비 감도의 문제가 아니다. 더 본질적으로는 TDM 분석법의 표준화가 얼마나 어려운지, 그리고 그 핵심이 어디에 있는지를 보여주는 사례라 할 수 있다.

 

1. TDM 분석법에서 ‘표준화’가 어려운 이유: 구조적인 문제들

TDM 분석법의 표준화 문제가 단순한 기술적 이슈가 아니라 구조적 한계에 가깝다는 사실을 이해하려면, 먼저 TDM 분석이 일반 small-molecule 정량 분석과 무엇이 다른지를 살펴볼 필요가 있다.

① 환자 생체시료의 이질성(Heterogeneity)

LC-MS/MS 분석에서 가장 까다로운 변수 중 하나는 매트릭스 효과(matrix effect)다. 하지만 일반적인 연구용 시료와 달리, TDM은 환자 혈액·혈장의 특성이 병원마다, 환자마다 너무 다르다는 태생적 한계를 갖는다.

• 혈장 단백질 농도의 차이
• 지질 농도 증가(lipidemia)
• 황달 환자에서 bilirubin 증가
• 항응고제 종류(EDTA, heparin 등)
• 약물 치료 및 병용약물에 따른 내인성 대사물 변화

이러한 특성은 ion suppression 또는 ion enhancement를 유발해 정량값에 직접적인 영향을 준다. 예를 들어 한 기관에서는 tacrolimus의 m/z 821 → 768 전이가 20% suppression을 보이는 반면, 다른 기관에서는 5% 수준일 수 있다. 동일한 LC-MS/MS 조건을 쓰더라도 매트릭스가 다르면 slope 자체가 달라지는 것이다.

② 기관마다 다른 표준물질(Standard)의 품질과 traceability

많은 임상 검사실에서는 상업용 표준물질을 사용하지만, 모든 표준물질이 **Certified Reference Material(CRM)**인 것은 아니다. Purity가 제조사 고지값에 의존하거나, 불확실도가 제공되지 않는 경우도 많다. 이 경우:

• Lot 간 농도 차이
• 제조사 간 purity 평가 방식 차이
• 실제 농도 대비 과대/과소 보고

등이 반복되면서 분석값의 절대 기준이 흔들린다. TDM에서 가장 중요한 것은 정확한 절대 농도인데, 이 절대값의 기반이 되는 “표준물질”이 확실하지 않으면 결과의 신뢰도는 근본적으로 흔들릴 수밖에 없다.

③ Sample preparation 워크플로우의 차이

TDM은 보통 ppb(ng/mL) 단위 농도 분석이 필요해 matrix effect에 민감하다. 따라서 연구실마다 다음 조건이 모두 다를 수 있다.

• Protein precipitation vs SPE vs LLE
• Internal standard의 구조적 유사성
• Extraction recovery
• 온도, vortexing, 원심 속도 차이

이런 차이는 calibration curve의 slope나 intercept의 변동으로 이어지고, 기관 간 비교 시 수십 퍼센트의 bias를 만든다.

이렇듯 TDM 분석법의 표준화는 단일 요인 문제가 아니라, 표준물질–매트릭스–추출–장비라는 전체 workflow가 복잡하게 얽혀 있는 전방위적 조화(harmonization)가 필요하다.

2. Calibration traceability(표준물질 계보성)의 핵심 개념

TDM 분석의 정확성은 결국 calibration traceability에서 시작된다.
Calibration traceability라는 단어는 다소 추상적으로 들리지만, 그 의미는 명확하다.

“우리가 사용하는 standard의 농도가 국제 기준에 정확히 연결되어 있는가?”

다시 말해, 자신의 분석용 표준물질(stock solution)이:

• 공인 기관에서 인증한 reference material에 기반해 있고
• purity가 정확히 계산되었으며
• 농도 조제 과정에 불확실성을 최소화하고 있는지

이 모든 요소가 충족되어야 한다.

① Certified Reference Material(CRM)의 중요성

가능하다면 모든 TDM 분석에는 ISO 17034 기준을 충족한 CRM을 사용해야 한다.
CRM의 장점은 다음과 같다.

• Purity가 qNMR 등 정확한 방법으로 검증됨
• 제조사에서 불확실도(uncertainty)를 제공
• Lot 간 품질 균일성 확보
• 국제 표준과 직접 연결됨

특히 tacrolimus, sirolimus, ciclosporin 같은 면역억제제는 글로벌 기관에서 이미 여러 CRM이 생산되고 있어 TDM 표준화에 유리한 편이다.

반면 CRM이 없는 약물의 경우, 제조사 식 purity 평가에 의존하게 되는데 이는 기관 간 절대 정량값 차이를 크게 만든다. 가장 대표적인 문제는 “purity 98%”라고 적혀 있어도 수분, 잔류 용매, 무기물 등을 제외한 실질 purity가 더 낮은 경우다.

② Stable isotope-labeled IS(SIL-IS)는 사실상 필수

TDM 분석에서는 matrix effect와 extraction recovery의 작은 변화도 농도에 직접적 영향을 준다. 따라서 SIL-IS는 단순 보정이 아니라 정량 정확도 확보의 핵심 요소다.

좋은 SIL-IS의 조건은 다음과 같다:

• 13C, 15N, 2H 기반 구조 동일체
• Precursor m/z만 isotope shift, fragment는 동일
• Elution time identical
• Sample prep 전체 과정에 spike

SIL-IS는 사실상 모든 분석 변동을 보정할 수 있는 유일한 요소로, 국제 harmonization 연구에서도 “SIL-IS 사용 여부가 기관 간 bias의 가장 큰 결정 요인”으로 나타난다.

③ Purity correction과 gravimetric dilution

표준물질 농도 조제에서 가장 중요한 원칙은 다음 두 가지다.

1. purity correction은 반드시 해야 한다
2. stock solution은 무게 기반(gravimetric)으로 제조해야 한다

Purity correction에는 다음이 반드시 포함되어야 한다.

• Water content(TGA 또는 Karl Fischer)
• Residual solvent
• Inorganic impurities
• Degradation products

모두 포함한 실제 purity(“real purity”)를 계산해야 한다.

또한 volumetric pipette로 소량을 취해 조제하는 방식은 온도, 점도, 기구 오차에 취약하므로 TDM 분석에서는 gravimetric dilution이 권장된다.

④ CRM이 없을 때: qNMR 기반 absolute purity 확보

CRM이 없는 약물의 경우, qNMR(quantitative NMR)이 유일하게 신뢰할 수 있는 purity 검증 방법이다.

qNMR은 다음과 같은 장점이 있다.

• 절대 정량(Absolute quantification) 가능
• 불확실도 계산 가능
• 광범위한 유기물 분석에 적용 가능

이미 많은 항생제·항암제·중추신경계 약물에서 qNMR 기반 purity가 국제 가이드라인으로 활용되고 있어 TDM 분석에서도 널리 사용된다.

3. Matrix harmonization(매트릭스 조화)의 필요성

Calibration traceability가 “절대 농도의 기준을 통일”하는 과정이라면,
Matrix harmonization은 “각 기관의 매트릭스 차이로 인한 편차를 줄이는 과정”이다.

왜 harmonization이 필요한가?

같은 CRM을 쓰고 같은 SIL-IS를 쓰더라도, 기관마다 사용하는 혈장·혈청의 matrix effect는 다르다. 이는 다음과 같은 이유 때문이다.

• 단백질 농도 차이 → ion suppression 증가
• 지질 증가 → LC column contamination, carryover
• 산화 스트레스 상태 환자 → 내인성 대사물 변화
• 항응고제 종류에 따른 pH 변화

결국 실제 임상 sample 분석 시 slope와 intercept이 달라지는 가장 근본 원인은 매트릭스 차이다.

TDM에서 환자의 결과가 기관마다 다르게 나오는 가장 큰 이유가 바로 여기 있다.

4. Surrogate matrix를 이용한 개선 전략

Matrix harmonization의 가장 일반적이면서 효과적인 전략이 바로 surrogate matrix 사용이다.

① Surrogate matrix란?

Surrogate matrix는 실제 혈장을 직접 calibration에 사용하지 않고, 다음과 같은 인공 혈장 기반 매트릭스를 사용해 표준곡선을 만드는 방법이다.

• Charcoal-stripped serum
• Commercial synthetic plasma
• Albumin/salt 기반 artificial matrix
• Drug-free certified human plasma

② 왜 surrogate matrix가 유리한가?

실제 혈장은 매번 단백질 농도와 내인성 물질 변화가 달라 slope 변화가 크다. 반면 surrogate matrix는:

• 항상 동일한 특성 유지
• batch-to-batch variation 낮음
• ion suppression variability 감소
• calibration curve의 재현성 향상

예를 들어 tacrolimus TDM에서 real plasma를 사용하면 기관마다 slope가 ±15% 범위로 변동하지만, surrogate matrix를 사용하면 ±5% 이하로 줄어든다는 보고가 있다.

③ Validation에서 반드시 평가해야 하는 항목

Surrogate matrix는 real plasma와 동일하지 않기 때문에 validation 과정에서 다음을 반드시 평가해야 한다.

• Slope difference
• Matrix effect(absolute MF)
• Recovery difference
• Selectivity
• Hemolyzed/lipemic/icteric plasma 비교

특히 matrix factor(MF) 비교는 harmonization 전략에서 핵심 변수다.

5. Matrix factor 기반 보정 전략

Matrix factor(MF)는 matrix effect를 수치적으로 표현한 지표로:

MF = Peak in presence of matrix / Peak in pure solution

MF가 1보다 작으면 suppression, 크면 enhancement다.

① MF를 사용하는 이유

기관마다 MF가 다르므로 이를 기반으로 slope 보정 계수를 도입하면 기관 간 정량값 차이를 크게 줄일 수 있다.

예를 들어:

• 기관 A의 MF = 0.75
• 기관 B의 MF = 0.92

두 기관의 calibration curve slope는 동일 CRM을 사용해도 다를 수밖에 없다.
따라서 MF 기반 보정계수를 적용하면 서로 다른 매트릭스를 '동일 조건'으로 변환할 수 있다.

② 국제 EQA 연구에서 MF 보정의 효과

Tacrolimus inter-lab harmonization 연구에서는 MF 기반 보정만으로도 분석값 편차가:

• 기존 ±20~30% → ±5% 이하로 감소

하는 효과가 관찰되었다.

이는 MF 보정이 단순한 보조가 아니라 harmonization의 핵심 도구임을 보여준다.

6. Common calibrator(공통 검량 스탠다드) 도입

Surrogate matrix와 MF 보정만으로도 많은 문제가 해결되지만, 가장 확실한 방법은 기관 간 동일한 calibrator batch를 공유하는 것이다.

① 장점

• slope 자체를 통일할 수 있음
• calibration traceability 강화
• inter-lab reproducibility 획기적으로 향상

② 단점

• 운송 중 온도, 안정성 이슈
• 대량 생산 및 장기 보관 필요
• QC 체계 복잡해짐

그럼에도 불구하고 유럽, 미국의 TDM 네트워크에서는 common calibrator를 광범위하게 사용하고 있다. 면역억제제 TDM harmonization 연구에서는 common calibrator 사용 시 기관 간 편차가 절반 이하로 감소했다.

 

실제 임상 TDM 사례에서 드러난 표준화 문제들

표준화가 왜 중요한지는 실제 임상에서 나타나는 여러 사례를 보면 더욱 분명해진다. 특히 항경련제(예: levetiracetam, carbamazepine), 항암제(예: methotrexate), 면역억제제(예: tacrolimus, cyclosporine)처럼 농도–효과 관계가 예측가능하고 치료지수가 좁은 약물에서는 검사값 오차가 환자의 치료 방향을 바꿔버릴 만큼 민감하다.

Tacrolimus TDM에서 반복적으로 보고된 inter-lab variation

Tacrolimus는 전혈 분석을 기본으로 하며, LC-MS/MS 기반 측정이 가장 정확한 것으로 알려져 있다. 그런데도 국가 간, 기관 간 결과는 여전히 큰 차이를 보인다.

• 동일 환자의 동일 샘플을 여러 기관에 보내면 최대 30~40%까지 결과가 차이 나는 사례가 보고돼 왔다.
• 이는 TRL1(치료 약물 농도 하한치) 근처에서는 복약 용량 결정에 큰 영향을 미친다. 예를 들어 4.5 ng/mL vs 6.1 ng/mL 차이만으로도 주치의는 용량 증량 여부에서 완전히 다른 판단을 내릴 수 있다.

이런 문제는 주로 다음 원인들이 복합적으로 작용한다.

1. Calibration traceability가 불완전하여 slope와 intercept가 사이트마다 다름
2. Matrix effect에서 전체 혈구 용량, 지질, 단백질 결합 정도의 차이를 보정하지 못함
3. Sample prep 전략이 기관마다 상이함(전혈 단백질 침전 방식, 내부표준 사용 여부 등)
4. “검사실 간 표준물질 공유 체계”가 없다시피 함

즉 동일한 LC-MS/MS 장비라도 분석법이 조금씩 다른 것만으로도 결과 값이 유의미하게 달라진다는 사실을 보여주는 대표적인 예이다.

항암제 MTX(Methotrexate) 고용량 치료 모니터링에서의 문제

Methotrexate TDM에서는 특정 시간대 농도(예: 24h, 36h, 48h)가 rescue therapy 조절에 결정적이다.
그러나 기관마다 MTX 정량값이 다르게 나오면 leucovorin rescue의 강도 및 지속 시간이 달라져 환자가 독성을 경험할 가능성이 커진다.

여기서도 똑같은 문제가 반복된다.

• Matrix 구성의 차이가 calibration curve slope를 변화시키고
• IS recovery 차이는 low concentration 구간에서 bias를 유발한다
• 표준물질의 농도 설정 방식이 기관마다 다르다
• Stability 차이(광 노출, freeze-thaw cycle, 용매 선택)가 미세한 농도 drift를 일으킨다

이처럼 TDM에서 표준화 문제를 해결하는 일은 단순히 분석의 정밀도를 높이는 데 그치지 않고, 환자의 선택 가능한 치료 범위를 넓히는 일과도 직결된다.

 

7. Matrix harmonization 전략 – 실제 TDM에서 가장 어려운 문제

Matrix harmonization은 “A 병원과 B 병원이 전혀 다른 환자군을 가지고 있어도, 분석 결과 값은 동일해야 한다”는 목표를 달성하기 위한 개념이다.

그러나 실제 matrix harmonization은 calibration traceability보다 훨씬 어렵다. 그 이유는 다음과 같다.

• 환자 개개인의 matrix는 서로 완전히 다르다
• 전혈·혈장·혈청의 matrix heterogeneity는 분석감도를 바꾼다
• Protein binding, hematocrit, bilirubin, triglyceride 농도가 matrix effect에 영향을 준다
• Matrix factor(MF)가 analyte마다 다르고 시간에 따라 변한다
• 내부표준(IS)조차 matrix 영향을 완전히 중화시키지 못한다

그래서 LC-MS/MS 기반 TDM의 국제 표준화를 위해서는 matrix harmonization 전략이 분석법의 중심으로 자리 잡을 필요가 있다.

7.1 Surrogate matrix를 표준화하는 방법

가장 많이 쓰이는 방법은 surrogate matrix 접근이다.

(1) 혈장 기반 분석에서 BSA-PBS surrogate matrix 사용

BSA 농도를 다양하게 조절하는 방식이다.

• Protein 4–5% 수준 설정
• Salt balance는 PBS 또는 physiological saline
• Lipid component은 제거된 상태
• Hemolysis나 bilirubin interference 없음

하지만 이것만으로 matrix effect를 충분히 반영하지는 못한다. 실제 환자의 정밀한 생화학적 조성을 모사하기 어렵기 때문이다.

(2) 전혈 분석에서는 synthetic blood matrix 구성

전혈 surrogate의 변수:

• Hematocrit
• RBC : plasma ratio
• Hemoglobin 농도
• Cell debris 농도
• pH

전혈 surrogate matrix는 실제보다 단순화돼 있어 MF가 실제보다 low-bias를 보이는 경향이 있다.

7.2 Pooled patient matrix의 활용 – 현실적이지만 한계가 존재

가장 현실적인 harmonization 전략은 환자 혈액을 모아 pooled matrix를 만드는 방식이다.

장점:

• 실제 환자의 matrix 구성 요소를 반영할 수 있다
• MF가 다양한 환자군의 평균값과 유사해진다
• Calibration curve의 실제 적용성을 높여준다

단점:

• 확보가 어렵다
• 보관 중 stability 차이가 발생한다
• 감염성 안전성 문제
• 단일 batch로 많은 실험을 수행하기 어렵다

하지만 현재 TDM 분석 실무에서는 여전히 pooled matrix가 가장 신뢰성 높은 전략으로 평가된다.

7.3 Matrix factor(MF) 기반 보정 전략의 고도화

현재 LC-MS/MS 분석에서는 MF 기반 보정이 다음 원리로 진행된다.

 

MF(analyte) = peak area in post-extraction spiked sample / peak area in neat solution MF(IS) = peak area in post-extraction spiked IS / peak area in neat IS Normalized MF = MF(analyte) / MF(IS)

 

이 normalized MF가 0.85–1.15 범위에 들어오면 matrix effect가 수용 가능한 것으로 본다.

그러나 TDM 분석은 더 높은 정확도를 요구하기 때문에 다음과 같은 고도화 전략이 필요하다.

(1) Individual matrix factor(IMF) 검증

10명, 20명 수준을 넘어 50명 이상 matrix에서 IMF를 평가해야 한다.
이런 접근은 실제 환자군을 보다 잘 반영한다.

(2) Matrix effect clustering 분석

환자 matrix를 3~4개의 그룹으로 나누어 IMF 프로파일을 분석하면
특정 population에서의 bias를 미리 파악할 수 있다.

예:

• 고지혈증 환자 cluster – 지질 기반 matrix effect ↑
• 신장질환 환자 cluster – uremic toxin 영향
• 어린이 환자 cluster – hematocrit 차이

이러한 cluster 분석은 최근 TDM 자동화 플랫폼 개발에서도 핵심 모듈이 되고 있다.

8. LC-MS/MS 기반 TDM에서 필수적인 내부표준(IS) 설계

IS는 TDM 분석에서 가장 중요한 보정 핵심이다. 특히 isotopically labeled IS는 아래 조건을 만족해야 한다.

1. Analyte와 동일한 이온화 efficiency
2. RT 차이가 ±0.03 min 이내
3. Fragmentation pathway도 동일
4. Stable isotope labeling (D4, C13, N15 등)을 사용
5. Surrogate matrix 또는 환자 matrix 양쪽에서 동등한 matrix effect 보정

그러나 IS가 완벽한 보정을 수행하지 못하는 경우가 많다. 이유는 다음과 같다.

• D4-labeled IS는 hydrogen–deuterium exchange로 인해 m/z shift가 불안정할 수 있음
• Matrix 구성 요소가 analyte와 다르게 IS에 영향을 주는 경우가 있음
• Ion suppression hotspot 영역이 analyte와 IS에서 미세하게 다르게 나타날 수 있음

이 때문에 최근에는 U-13C/U-15N 완전 동위원소 IS(Uniformly labeled IS)를 가장 이상적인 IS로 본다.
비용이 높지만 TDM 분석법의 표준화에는 필수적이다.

9. Sample preparation 표준화 – 기관 간 편차가 가장 크게 나타나는 지점

Sample prep은 LC-MS/MS 분석법에서 기관별 차이가 가장 크게 나타나는 단계이다. 특히 TDM 분석에서는 다음 요소들이 절대적으로 중요하다.

9.1 Protein precipitation vs LLE vs SPE 선택 문제

TDM 분석법에서 가장 많이 사용하는 방법은 다음과 같다.

• 전혈 – protein precipitation(ACN)
• 혈장 – protein precipitation + dilution
• 특수 약물 – SPE
• 지질 많은 matrix – dual-phase LLE

그러나 분석실마다 ppt 조건이 달라 small variation이 결과로 이어진다.

예를 들어:

 

변수	작은 변화	영향
Organic solvent ratio	2:1 vs 3:1	Recovery shift
Precipitation vortex 시간	10초 vs 20초	MF화 경향
Centrifuge g-force	10,000g vs 14,000g	잔여 단백질량 차이
Supernatant transfer depth	pipette depth 1mm 차이	ion suppression 영역 변화

이처럼 작은 변수도 누적되면 dataset bias를 일으키게 된다.

9.2 Sample prep 자동화의 필요성

TDM용 LC-MS/MS는 자동화가 특히 필요하다.

자동화의 장점:

• Pipette volume variation 감소
• Mixing uniformity 확보
• Solvent addition consistency 향상
• IS 분주 정밀도 상승
• Analyst 개인 숙련도의 영향을 줄임

이를 위해 최근 병원·분석실에서는 다음 장비들이 적극 도입되고 있다.

• Automated liquid handling system
• Robotic plate preparation system
• Automated SPE
• On-line sample extraction LC-MS/MS

자동화는 TDM 분석의 표준화를 가장 현실적으로 앞당길 수 있는 방법이기도 하다.

10. LC-MS/MS 장비 및 소스 조건의 표준화

10.1 Ion source tuning의 편차

ESI 소스 튜닝은 장비 제조사별로 권장값이 다르며, 분석가마다 세팅하는 방식도 다르다.

예:
Spray voltage
Sheath gas
Auxiliary gas
Temperature
Capillary temp
S-lens RF level

이 수많은 변수들은 모두 ionization efficiency에 영향을 준다. 따라서 TDM 분석에서 허용되는 수준의 편차로 조정하기 위해서는 다음 전략이 필요하다.

10.2 System suitability test(SST) 표준화

SST는 DIA(Delivered Ion Abundance) 기반으로 더 엄격하게 설계할 수 있다.

SST 조건 예:

1. IS peak area 범위
2. analyte-to-IS response ratio
3. RT tolerance
4. Interference scan
5. Carry-over test
6. Precision(RSD) < 3%

SST 기준이 엄격할수록 inter-lab reproducibility는 높아진다.

11. Method validation의 국제 표준화 방향

TDM 분석법의 validation은 단순히 accuracy와 precision을 평가하는 수준을 넘어야 한다.
국가 간, 기관 간 비교를 위해 다음과 같은 validation 요소가 요구된다.

11.1 Harmonized validation protocol

기존 FDA/EMA/ICH M10 가이드라인은 바이오분석법 전반을 포괄하지만, TDM 특화 validation은 부족하다.
따라서 다음 요소를 강화하는 방향으로 국제적 조율이 필요하다.

1. Traceability validation – 원료·표준물질 수준에서 체계적으로 확인
2. Inter-lab bias 평가 – proficiency test로 정기 평가
3. Matrix harmonization 검증 – 다양한 환자군 기반 matrix 테스트 포함
4. IS stability 검증 강화 – IS degradation은 결과 오차의 대표 원인
5. Sensitivity validation 재정의 – ultra-trough 구간을 고려한 LLOQ 필요
6. Population cluster-based accuracy 평가 – 특수 환자군 고려(소아·신기능 저하 환자 등)

11.2 비임상-임상 간 Standard bridging

TDM 분석법은 비임상 단계에서 먼저 구축되는 경우가 많지만, 비임상 matrix와 임상 matrix는 완전히 다르다.

따라서 bridging 과정이 필요하다.

• QCs를 이용한 slope equivalence test
• Intercept shift 평가
• IMF 차이 분석
• Parallelism test 적용

이런 bridging 전략은 향후 GLP 기반 TDM 플랫폼 개발에도 핵심이 된다.

 

12. Inter-lab reproducibility 확보를 위한 Proficiency Testing(PT)의 중요성

TDM 분석법이 안정적으로 운영되기 위해서는 한 기관의 정확성보다 더 중요한 것이 있다. 바로 기관 간 재현성(inter-lab reproducibility)이다. 이 개념은 단순히 QC accuracy를 맞추는 차원을 넘어, 실제 임상 진료 환경에서 환자의 약물 용량을 동일하게 조절할 수 있는지를 결정한다.

PT(숙련도 평가)는 이를 측정할 수 있는 유일한 도구이다.

12.1 PT 프로그램의 기본 구조

PT 프로그램은 보통 다음과 같은 절차로 진행된다.

1. 중앙 기관에서 homogenized sample 준비
2. 택배·냉동 보관 형태로 참여 기관으로 전달
3. 기관별 분석 후 결과 제출
4. 중앙 기관에서 robust 평균 기반으로 Z-score 산출
5. 평가서 회신 및 개선 권고

여기서 ‘robust 평균’이라는 방식이 중요한데, 극단값의 영향을 줄이기 때문에 PT 결과를 보다 공정하게 평가할 수 있다.

12.2 TDM 약물별 PT 결과가 보여주는 특징

Tacrolimus, Cyclosporine, Sirolimus, MTX 등에 대한 국제 PT 데이터는 몇 가지 공통점을 보여 준다.

1. 중앙값 대비 ±20% 이상 벗어난 기관이 항상 존재한다
2. 동일 기관이라도 batch 간 변동성이 큰 곳이 있다
3. Extraction recovery 차이가 matrix-induced bias의 주요 원인
4. Isotopically labeled IS 품질에 따라 PT 결과가 변화
5. Instrument tuning drift로 인한 long-term bias가 나타난다

즉, LC-MS/MS 기반이라고 해서 자동으로 표준화되는 것이 아니라는 점을 증명한다.

13. 국내 TDM 분석 환경에서 표준화가 어려운 이유

국내 병원·제약사의 TDM 분석 환경은 매우 빠르게 발전하고 있지만, 실제로 표준화를 어렵게 만드는 몇 가지 구조적 현실이 존재한다.

13.1 분석 인력과 장비의 다양성

대형 상급종합병원은 triple quadrupole 장비 여러 대를 가지고 있고 자동화 플랫폼까지 갖춘 반면, 중소 병원은 단일 장비로 여러 분석을 병행하는 경우가 많다.
이 격차는 곧 ‘방법론적 편차’로 이어진다.

13.2 표준물질 공급 체계의 부재

NIST·EDQM 같은 CRM 공급원이 국내에는 아직 충분히 없다.
따라서 병원들은 상업용 표준물질에 의존할 수밖에 없고, 자연스럽게 traceability 균질화에 장애물이 생긴다.

13.3 Matrix harmonization을 위한 pooled matrix 확보의 어려움

윤리적·법적 절차가 까다롭기 때문에 대량의 전혈·혈장 matrix를 확보하기가 쉽지 않다.
이는 곧 calibration과 QC의 matrix 일관성 부족으로 이어진다.

13.4 임상 검사실 간 정보 교류 부족

미국에서는 TDM 관련 QC·PT 데이터를 병원 간 공유하는 네트워크가 존재하지만, 국내에서는 개별 기관 단위 운영에 가까워
노하우와 실패 경험이 공유되지 않는 경우가 많다.

14. 해결 전략 ① – National CRM 기반의 Calibration Traceability 확립

국가 기관(NMI) 주도의 추적성 체계를 구축하는 것은 TDM 분석의 최종 표준화에 가장 큰 영향을 미친다.

14.1 제약사-NMI 협력 모델

실제로 API를 가장 고품질로 보유한 곳은 제약사다.
따라서 아래 모델이 가장 현실적이다.

 

국가 분석기관(NMI) → API 원료 확보 → 고순도 PRM 인증 → sCRM 개발 → 병원·연구기관으로 배포

이 방식으로 운영되면,

• Calibration slope 편차 감소
• 제조사 간 working standard 농도 비교 가능
• PT 결과 품질 향상
• Matrix harmonization 평가가 쉬워짐

이라는 장점이 생긴다.

15. 해결 전략 ② – Pooled Matrix Bank 구축

Matrix harmonization의 핵심은 양질의 pooled matrix를 확보하는 것이다.

15.1 Centralized Biobank 모델

국가 단위 또는 권역 단위로 TDM Matrix Biobank를 구축하면 다음과 같은 효과가 있다.

• 다양한 환자군의 matrix 구성 요소 반영
• batch-to-batch variability 최소화
• multi-analyte TDM 분석법 개발 용이
• Population-specific MF 분석 가능

예:
신장질환군, 소아군, 고지혈증군, 면역억제제 투여군 등
population별 현장성을 반영한 matrix를 구축할 수 있다.

16. 해결 전략 ③ – Automated Sample Prep 플랫폼 도입

수동 sample prep은 LC-MS/MS 분석법의 최대 오차 원인이다.
특히 전혈 기반 TDM에서는 pipette technique 변동에 의한 오차가 상당히 크다.

16.1 LC-MS/MS 기반 TDM 자동화의 구조

 

Sample barcode → IS 자동 분주 → Protein precipitation → Centrifuge → Supernatant 취함 → Transfer → Injection → Data 처리

이 과정이 자동화되면,

• intra-lab reproducibility 향상
• inter-lab variability 감소
• PT 결과가 안정화
• 환자군이 달라도 bias가 줄어듦

이라는 직접적인 효과가 나타난다.

17. 해결 전략 ④ – AI 기반 QC drift 감지 시스템 구축

최근 LC-MS/MS 분석에서 AI는 단순한 peak picking 수준을 넘어,
slope drift·RT shift·fragment ratio 변화·carry-over 증가 패턴 등을 자동으로 감지할 수 있는 수준까지 발전하고 있다.

17.1 Drift detection AI의 개념

AI는 QC, blank, reagent data를 시간순으로 입력받아 특정 패턴을 학습한다.

예:

• Ion source fouling → peak area가 일정 비율로 감소
• Mobile phase batch 변경 → RT shift
• Column aging → peak width 증가
• ESI efficiency 변화 → fragment ratio 변화

이런 변화가 일정 threshold를 넘으면 자동으로 alert를 발생시킨다.

17.2 TDM 분석에 적용할 때의 장점

• Day-to-day slope drift를 빠르게 감지
• QC acceptance decision을 자동화
• Analyst 실수 가능성 감소
• inter-lab reproducibility 증가
• Long-term stability가 확보됨

AI 기반 모듈은 향후 국제 TDM 표준화 가이드라인에 포함될 가능성이 높다.

18. 해결 전략 ⑤ – Inter-instrument harmonization

동일 제조사·동일 모델의 LC-MS/MS 장비라도,
튜닝 방식과 maintenance history가 다르면 같은 농도라도 결과가 다르게 나올 수 있다.

18.1 공통 튜닝 프로토콜 도입

모든 기관이 동일한 튜닝 절차를 사용한다면 장비 간 편차를 줄일 수 있다.

예:

1. ESI voltage 단계별 튜닝
2. Gas-flow normalization
3. S-lens threshold 표준화
4. Source temperature 검증
5. Instrument response factor(IRF) 측정

이런 조정 표준은 TDM 분석법 표준화의 필수 요소다.

19. 사례 연구: Tacrolimus TDM 분석법의 국제 표준화 시도

Tacrolimus은 TDM 분야에서 가장 활발하게 표준화 연구가 이루어진 약물이다.

19.1 국제 협력이 만든 변화

• EDQM이 CRS를 제공
• NIST가 tacrolimus solution CRM 개발
• 여러 국가가 PT 프로그램 운영
• 전혈 matrix harmonization 연구 진행 중

이런 요인들로 인해 tacrolimus의 전 세계 inter-lab variability는 과거보다 크게 줄었다.

19.2 실제 개선 폭

초기(2000년대 초)
→ inter-lab CV 약 25~35%

최근(2020년대)
→ inter-lab CV 약 8~15%

아직 완벽하지는 않지만, calibration traceability와 matrix harmonization이 함께 이루어질 때 표준화가 실제로 가능하다는 것을 보여주는 대표적 사례이다.

20. 향후 LC-MS/MS 기반 TDM 플랫폼의 발전 방향

20.1 Full-automation 기반 TDM 검사실

미래 TDM 검사실은 “시료 투입 → 결과 리포팅”까지 자동으로 진행되는 형태가 될 가능성이 크다.

구조 예시:

 

자동 시료 분주기 → 자동 IS 처리 → 자동 ppt → on-line SPE → high-throughput LC → Triple quad MS → AI 기반 QC drift 분석 → LIS 전송

20.2 Multi-analyte TDM panel

개별 약물 단일 분석에서 벗어나,
면역억제제·항경련제·항정신병제 등 여러 약물을 동시에 정량하는 패널 방식이 대세가 되고 있다.

장점:

• 분석 시간이 크게 단축
• 환자 모니터링 효율 상승
• 자동화·표준화 용이
• Calibration traceability 구축이 수월해짐

20.3 TDM 데이터를 이용한 AI 기반 복약용량 자동 추천

LC-MS/MS 데이터는 ‘농도’라는 정량 정보이기 때문에 PK 모델·AI 예측 모델과 결합하기 쉽다.

예:

• Bayesian dose adjustment
• Deep-learning 기반 exposure prediction
• Population-specific dose recommendation
• PK-PD 통합 플랫폼 구축

이런 시스템은 향후 TDM 분석의 임상적 가치를 최대화할 것이다.

21. 결론 – Traceability와 Harmonization은 더 이상 선택이 아닌 필수

TDM 분석법의 LC-MS/MS 표준화는 단순히 정확한 분석을 위해서만 필요한 것이 아니다.
이는 곧 “환자가 어디서 치료를 받든 동일한 약물 농도 해석과 동일한 치료 결정을 할 수 있는가?”라는 의료의 본질적 질문과 연결된다.

이제 TDM은 다음 3가지 축이 모두 맞물릴 때 완전한 표준화가 가능하다.

① Calibration traceability

PRM → sCRM → working standard → calibration curve
이 흐름이 명확해야 한다.

② Matrix harmonization

환자군 차이로 인한 matrix effect 변동을 최소화해야 한다.

③ Inter-lab reproducibility 확보

PT, automated sample prep, AI drift monitoring 등 종합적 전략이 필요하다.

이 세 가지가 유기적으로 연결될 때,
LC-MS/MS 기반 TDM 분석법은 개별 기관의 기술 수준을 넘어 국가 단위·국제 단위의 통합된 표준체계로 자리 잡게 된다.