LC-MS/MS 기반 대사체 Stability 시험 설계– Freeze-thaw, Freeze-dry, Light exposure 등 변수 평가 전략

 

1. 서론 – 바이오마커 기반 정밀의료와 시료 안정성의 중요성

최근 대사체 기반 바이오마커가 다양한 질환 진단 및 예후 예측에서 주목받고 있습니다. 특히 면역계 질환, 대사 질환, 신경계 질환과 관련한 바이오마커 발굴 연구가 활발히 진행되며, 이들을 정량하는 LC-MS/MS 기반 분석법의 정확도와 신뢰성 확보가 점차 중요해지고 있습니다.
그러나 이 과정에서 종종 간과되는 부분이 바로 시료의 저장 및 처리 과정에서의 stability(안정성) 문제입니다. freeze-thaw(동결-해동), light exposure(광 노출), freeze-drying(동결건조) 등 다양한 외부 변수는 시료 내 대사체의 변형 또는 분해를 유도하며, 결과적으로 분석 신호의 재현성을 저하시킬 수 있습니다.

본 글에서는 LC-MS/MS 기반 분석을 위한 대사체 안정성 평가 시 고려해야 할 주요 변수들과, 실제 stability 시험 설계 시 활용할 수 있는 실무 전략을 공유하고자 합니다.

LC-MS/MS 기반 대사체 Stability 시험 설계– Freeze-thaw, Freeze-dry, Light exposure 등 변수 평가 전략

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2. Stability 시험의 기본 개념과 ICH Q2(R2)의 해석

대사체 안정성 시험은 일반적으로 분석법 밸리데이션 단계에서 포함되며, ICH Q2(R2)와 FDA/EMA의 바이오애널리시스 가이드라인에서도 다음의 항목들이 권고됩니다:

• Short-term stability (실온 노출)
• Long-term stability (냉동 또는 냉장 저장)
• Freeze-thaw stability (해동 및 재동결 반복)
• Post-preparative stability (추출 후 분석 전까지의 보관 안정성)
• Stock solution stability (표준물질 및 내부표준 안정성)

단, 대사체 분석의 경우 기존 가이드라인보다 더 민감하고 세밀한 조건이 필요합니다. 왜냐하면, 일부 대사체는 산화, 광분해, 또는 pH 변화에 극도로 민감하여 약간의 보관 조건 변화만으로도 분석 결과에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문입니다.

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3. 변수별 평가 전략

3.1 Freeze-thaw cycle stability (동결-해동 안정성)

시험 설계

• 최소 3회 이상 freeze-thaw cycle 진행
• –80℃에서 24시간 이상 보관 → 실온 해동 (완전 해동) → 즉시 재냉동
• 시료는 저농도(QCL) 및 고농도(QCH) QC 시료 기준

실무 팁

• 혈장 내 일부 대사체는 2회 이상 해동 시 분해 비율이 급격히 증가합니다.
• 단백질 binding이 강한 대사체일수록 해동 시 벽면 흡착에 의해 손실이 심할 수 있음 → non-binding 튜브 사용 권장

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3.2 Light exposure (광 노출 안정성)

광 노출 민감성 대사체 예시

• 트립토판 대사체 (예: kynurenine)
• 비타민 계열 (예: riboflavin)
• flavonoids, bile acids 등

시험 설계

• UV-A(365nm) 또는 형광등 조건에서 노출 (2~6시간)
• 투명 튜브 vs 갈색 튜브 비교

용기 선택 팁

• 갈색 polypropylene tube는 UV-B까지 차단하나, 일부 파장 대역은 완전 차단 불가
• UV-blocking 특수 튜브 또는 foil wrap 병행 필요

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3.3 Freeze-drying (동결건조)

장점

• 장기 보관 가능
• 농축 효과에 따른 감도 향상

단점

• 재수화 과정에서 pH 또는 osmotic imbalance 발생
• 열 불안정 대사체의 변성 가능

실무 적용

• 비휘발성 buffer(예: ammonium acetate 10 mM 이하) 사용 권장
• 재수화 시 0.1% formic acid 함유 mobile phase로 직접 재용해

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3.4 pH, 온도, 산화 조건 평가

• 혈장 시료의 pH 변화에 따라 lactate, pyruvate 등 민감 대사체가 분해
• 저온 보관 시에도 잔존하는 효소 활성에 의해 일부 대사체의 지속적 변화 가능
• 항산화제(예: BHT, EDTA, DTT 등) 사전 첨가 필요 여부 평가

사례

• Short-chain fatty acids(SCFAs) 정량 시 1% formic acid 첨가로 안정성 유지
• Glutathione(GSH/GSSG) 분석 시 NEM(alkylation reagent) 처리로 산화 방지

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4. Sample integrity 확보 전략

4.1 Sample collection 직후 처리

• 즉시 냉각(ice bath) 및 protease inhibitor 첨가
• 내부표준(IS) 조기 첨가 → extraction loss 최소화

4.2 Transport & Storage

• dry ice 운반
• 장기 저장 시 –80℃ 이하 ultra-freezer 사용
• QC sample 포함한 batch design → 분석 중 degradation 여부 모니터링

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5. LC-MS/MS 기반 stability 분석 workflow 예시

단계	설명
시료 준비	분석 대상 시료, QC 시료 준비
stability test	조건 별 (실온, 냉동, 해동, 광 등) 노출 시험 진행
분석법 수행	동일 분석 batch에서 동시에 측정
결과 비교	신호 세기, 정량값의 bias 및 CV 계산
허용 기준	±15% 이내 bias, CV 15% 이내 유지 여부 확인

 

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6. 실제 실험 예시 (SCFA 분석 기준)

목표: Acetate, Propionate, Butyrate 등의 안정성 평가

조건	Bias (%)	CV (%)
3회 Freeze-thaw	–12.3	8.5
4시간 광노출 (형광등)	–18.5	12.1
갈색 튜브 사용 시 광노출	–4.2	4.5
동결건조 후 재수화	–10.8	6.7

 

→ 갈색 튜브 사용 및 동결건조 보관이 안정성 확보에 효과적

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7. 결론 및 실무 적용 요약

대사체 분석에서의 stability 시험은 단순한 보완 항목이 아니라, 전반적인 데이터 신뢰성을 결정짓는 핵심입니다. 특히 freeze-thaw, light, drying, pH 등 여러 변수들이 복합적으로 작용할 수 있기 때문에, 분석법 개발 초기부터 stability 이슈를 병행하여 고려해야 합니다.

실무 요약

• freeze-thaw: 최대 3회까지 반복 시험 → IS 조기 첨가 권장
• light exposure: 갈색 튜브 및 foil wrap 필수
• 동결건조: buffer 조성 조절 및 재수화 조건 표준화
• 항산화제: 대사체 특성에 따라 선택적 첨가
• QC 시료 병행 분석으로 degradation 여부 확인

향후 정밀의료 시대에 맞춰 다양한 대사체 기반 바이오마커가 개발될수록, 그 기반이 되는 시료 안정성 확보는 더욱 중요해질 것입니다. 단순히 분석법의 민감도뿐만 아니라, 그 데이터를 뒷받침할 수 있는 robust한 sample stability 전략이 필요한 시점입니다.