시료 내 단백질 흡착(Adsorption) 문제 해결 전략 – LC‑MS/MS 정량 정밀도 확보 방안

1. 서론: 정밀 측정을 방해하는 보이지 않는 적, ‘흡착’

LC‑MS/MS 분석법은 정밀하고 감도가 높은 바이오분석 도구로서, 특히 단백질 기반의 바이오마커, 항체나 펩타이드 분석에 널리 활용됩니다. 하지만 한 가지 예상치 못한 문제는 흡착(adsorption)입니다. 특히 매우 낮은 농도(ng/mL 이하) 시료에서는 단순히 기기의 감도보다 흡착에 의한 시료 손실이 분석 결과를 왜곡시키는 주요 원인이 됩니다.

흡착은 보통 튜브, 피펫 팁, LC vial, autosampler tray 등 시료가 닿는 모든 표면에서 발생할 수 있으며, 이로 인한 비가역적 손실은 정밀도·정확도를 낮출 뿐 아니라 반복 측정 시 재현성 확보에도 심각한 방해 요소가 됩니다. 예를 들어, NHL mouse serum spike 농도 0.5 ng/mL 분석 시, LoBind 제품 사용 전후 회수율 차이는 무려 30%를 넘는 경우도 보고되고 있습니다.

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2. 흡착이 발생하는 주요 원인과 그 영향

2.1 흡착 발생 메커니즘

• 친수성 단백질이 플라스틱 표면과 상호작용하여 부착 → 회수율 저하
• 흡착된 분자는 소멸되지 않고 표면에 고정 → 재분석 시 signal 없음
• 흡착이 불균일하게 발생 → 반복 측정 시 CV 증가

2.2 정밀도 및 정확도에 미치는 영향

영향 항목	구체적 증상
Accuracy	평균 측정값이 기대치보다 낮음
Precision (CV)	반복 측정 시 값 간 편차 큼
Sensitivity	낮은 농도 시 sensitivity 저하
Calibration curve	slope flattening, intercept 이상

 

흡착 문제는 특히 LLOQ 부근에서 나타나는 농도 왜곡을 유발해 calibration curve에서 선형성을 잃게 만듭니다.

 

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3. 효과적인 흡착 방지 기법

3.1 Low‑Binding 튜브 및 실리콘 코팅 제품 사용

• Eppendorf LoBind, Axygen MaxRecovery, siliconized vial 등의 제품은 흡착을 최소화하도록 제조됨
• 실험 사례: peptide A (0.5 ng/mL) 분석 시 LoBind 튜브 사용 후 회수율이 일반튜브 대비 65% → 95%로 증가

3.2 Pre‑Blocking 처리 전략

• 튜브나 팁을 BSA (1%), gelatin 또는 casein을 사용해 미리 blocking
• 또는 분석 대상 농도 × 0.1 수준의 peptide를 미리 넣어 surface saturate

3.3 희석 buffer 조성 최적화

• 0.01% Tween‑20 또는 Polysorbate 20 등 계면활성제 소량 첨가
• 1–2% MeOH, DMSO 등으로 surface tension 변화 및 흡착 억제

주의: 계면활성제 및 용매 사용 시 LC-MS/MS instrument compatibility 반드시 검증 필요

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4. 흡착 방지 전후 비교 사례 (실험 데이터)

4.1 회수율 비교

 

조건	회수율 (%)	CV (%)
일반 PP 튜브	56	12.5
LoBind 튜브	95	4.2
LoBind + Pre-blocking	98	3.7

 

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4.2 Calibration curve 비교

LoBind 미사용 시 slope가 급격히 낮아져 low-concentration 구간에서 선형성 깨짐
LoBind + blocking 조건에서는 slope 안정성 확보, R²≥0.995 유지

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5. 밸리데이션 시 흡착 고려 요소

5.1 Accuracy & Precision 체크

• LLOQ level QC sample은 흡착 민감도가 가장 높으므로 반복 측정 시 CV ≤15% 유지되어야 함
• 흡착 과정을 밸리데이션 보고서에 명시하고, LoBind 등 특별한 용기 사용 사실 기술 필수

5.2 Stability 평가

• Bench‑top stability, freeze–thaw, autosampler stability 등에서 흡착 손실 여부 확인
• 동일 탄약 vial에 시료 보관하더라도 자기 흡착 가능성이 있기 때문에 시간 경과별 농도 변화 체크

5.3 Carryover 영향 점검

• 흡착된 분자가 다음 vial에 흘러나오거나 blank에 영향을 줄 수 있으므로 High QC 후 Blank injection 관찰 필요

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6. 실무 팁: 분석 워크플로우 개선 전략

1. Sample collection 시부터 LoBind tube 또는 siliconized vial 사용
2. Pre-blocking: BSA 1% solution 1시간 incubate 후 버림
3. Sample dilution: 분석 초기에 계면활성제 소량 포함된 buffer 사용
4. Analysis sequence 설계: Low QC 후에 추가 blank 분석 수행
5. Validation report: 흡착 방지 조건, 회수율 CV 결과, calibration curve linearity 그래프로 포함

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7. 관련 문헌 및 권고사항 요약

• FDA Bioanalytical Guidance (2018):
  “Sampling and storage conditions must be validated for analyte stability, including adsorption to plastic or glass surfaces.”
• Smith et al., J Chrom B, 2022:
  "LoBind 사용이 ng/mL peptide 분석의 정밀도와 accuracy 향상에 결정적 역할"

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8. 결론: 정밀 분석의 시작은 '흡착의 차단'부터

흡착은 극미량 분석에서 종종 간과되지만, 정량 정확성, 반복성, 선형성 등 분석법의 신뢰도를 결정하는 핵심 변수입니다. 일반 PP 튜브에서 LoBind 또는 blocking 처리된 용기로 전환하는 것은 단순한 샘플링 변경이 아니라 분석의 근간을 안정화하는 과정입니다.

분석자라면, LC-MS/MS method 개발 초기에 반드시 흡착 위험을 인지하고, 이를 최소화하는 전략을 SOP에 포함해야 합니다. 특히 희귀질환 치료제, 항체 기반 biomarker, IPC (Incurred Sample Reanalysis) 등이 중요한 경우, 흡착을 고려하지 않은 정량법은 임상적 의미를 잃을 위험이 있습니다.