SCFA(Short-Chain Fatty Acids), BCAA(Branched-Chain Amino Acids), ketone bodies(β-hydroxybutyrate,acetoacetate, acetone) 분석법 표준화(standardization)

 

1) 개요 — 왜 표준화가 중요한가 

• SCFA·BCAA·ketone body는 질병 지표·대사 상태·약물 영향을 직접 반영.
• 하지만 매트릭스 영향·전처리 방법 차이·분석 플랫폼 차이로 결과가 매우 달라진다.
• 표준화 목표: 재현성(실험간/실시간), 정확성(정량성), 추적성(문서화) 확보 → 임상/비임상 결론의 신뢰성 보장

핵심 원칙(간단)

1. 샘플 수집·보관 표준을 먼저 고정
2. 가능한 한 동위원소 표지 내부표준(ILIS) 사용
3. matrix-matched calibration 또는 standard addition 고려
4. method validation(특히 stability, matrix effect, LLOQ) 필수

2) 표본별 실무 전처리 지침

기본 전제: 분석은 LC-MS/MS 기반 정량을 우선으로 하되, 필요 시 GC-MS/enzymatic 병행

A. 혈장/혈청

• 채혈관: EDTA 또는 heparin (분석실 표준에 따라 통일). Ketone/SCFA 분석 시 EDTA 권장.
• 채혈 후 즉시(≤30 min) 4°C에서 원심분리(1,500–2,000 g, 10 min) → 상등액(플라즈마) 취해 −80°C로 냉동 보관.
• Hemolysis, lipemia 표기 (QC/해석 필수).
• 전처리: 단백질 침전(PPT; MeOH 또는 ACN 3–4× volume) → 원심분리 → 상등액 희석/정제 → 주입(비유도체법) 또는 유도체화.

B. 전혈(Whole blood) / DBS/VAMS

• Hematocrit 영향 고려 (정량 correction 필요).
• VAMS/DBS는 채혈·건조·취급 표준화(spot size, drying time) 필수.

C. 소변

• 채취: 중간뇨 권장, creatinine 동시 측정.
• 보관: 즉시 −80°C 권장. 장기 보관 시 pH/세균 성장 억제를 위해 0.1% NaN₃ 또는 냉동 권장(내부 규정 확인).
• 전처리: 희석/원심분리 → 필터링 → 유도체화(필요시) 또는 직접 분석(HILIC 등).

D. 대변(장내 SCFA)

• 수거: 무균 tube에 충분량(≥0.5 g) → 즉시 냉동(−80°C) → 가능한 한 산성화(예: 0.5 M HCl 소량 첨가)로 SCFA 안정화(선택적).
• 전처리: 균일화(homogenize) → 2-propanol/MeOH 추출 또는 direct extraction(ether) → derivatization 권장(감도·정량성 향상).

E. 조직

• 즉시 snap-freeze(냉동질소) → −80°C 보관. 균질화시 내부표준 첨가 후 추출(organic solvent).
• SCFA는 조직 함량이 낮아 민감도 확보 위해 유도체화 필수.

3) 분석법 옵션 비교

분석 목표	권장 플랫폼	전처리/유도체화	장점	단점
SCFA (plasma/urine/feces)	LC-MS/MS (3-NPH deriv) or GC-MS (PFBBr or direct acid extraction)	3-NPH (EDC coupling) / PFBBr or propylation	높은 감도·특이성(유도체)	유도체화 단계가 필요, 방법 복잡
BCAA (plasma)	LC-MS/MS (AccQ-Tag / AQC deriv) or direct HILIC/IB	AQC(AccQ-Tag) 또는 비유도체 HILIC	높은 재현성, 임상 적용 용이	일부 장비·시약 비용
Ketone bodies (BHB, AcAc, acetone)	LC-MS/MS (유도체화: pentafluorobenzyl, 3-NPH 옵션) or enzymatic	Derivatize or enzyme assay	BHB 정량성 우수, AcAc 불안정성 보정 가능	AcAc 불안정, enzymatic 간편하지만 multiplex 불리

참고: 위 유도체명은 분석계에서 흔히 쓰이는 옵션입니다. 실험실 여건·규제 요구에 따라 선택하세요.

 

4) 권장 SOP — SCFA / BCAA / Ketone 각각

아래 SOP는 ‘현장 적용형’으로 간단화했습니다. 작업 환경·안전 매뉴얼·레지멘트 따라 세부 조정하세요.

A. SCFA (plasma / feces) — 권장: 3-nitrophenylhydrazine(3-NPH) 유도체 + LC-MS/MS

(이 방법은 최근 다수 연구에서 감도·정량성 면에서 우수하다고 보고됨)

개요

• 원리: 카복실산을 3-NPH와 EDC 활성화로 hydrazone화 → UV/ESI+ 신호 향상
• 타깃: acetate, propionate, butyrate, isobutyrate, valerate 등

시약(예시)

• 3-NPH (ᵇ) 200 mM in MeOH
• EDC·HCl (water soluble carbodiimide) 120 mM in water (or pyridine buffer)
• IS: 13C-labelled SCFA mix (가능하면 각 성분별)

전처리 SOP (plasma)

1. Thaw samples on ice. Vortex.
2. Aliquot 50–100 μL plasma → add IS (e.g., 10 μL).
3. PPT: add 3–4× volume cold MeOH, vortex 1 min, incubate 10 min on ice.
4. Centrifuge 15,000 g, 10 min, 4°C → collect supernatant.
5. Evaporate if 필요 (N₂ stream) → reconstitute in 50 μL 50% MeOH.
6. Derivatization: add 20 μL 3-NPH, add 20 μL EDC solution, incubate 30–45 min at 40°C.
7. Quench: dilute with mobile phase, centrifuge, inject (LC-MS/MS).

LC-MS 조건(권장 가이드)

• Column: reversed phase C18 (50×2.1 mm, 1.7 μm) or phenyl
• Mobile phases: A: water+0.1% FA; B: ACN+0.1% FA
• Gradient: fast gradient (0–3 min) depending on derivatized RT
• MS: ESI(+), MRM transitions for derivatized ions; ILIS 사용으로 IS-normalized quant.

Feces 특별 주의

• Homogenize (e.g., 10 mg feces + 500 μL MeOH) → vortex, sonicate → centrifuge → proceed derivatization on supernatant.
• Consider acidification pre-extraction to release SCFA (HCl to pH <2), but then neutralize before derivatization if needed.

B. BCAA (Leu/Ile/Val) — 권장: AccQ-Tag (AQC) derivatization + LC-MS/MS (or UPLC-UV for amino acid)

개요

• BCAA는 아미노산 그룹으로 일반적으로 amino acid analysis 시약(AccQ-Tag, AQC)이 널리 쓰임. AQC는 안정적 유도체 생성으로 소량 정량에 유리.

전처리 SOP (plasma)

1. Thaw on ice. Aliquot 20–50 μL plasma → add IS (e.g., 13C6-Leu etc.).
2. Deproteinize: add 3× MeOH (or 10% sulfosalicylic acid), centrifuge 15,000 g, 10 min.
3. Transfer supernatant → evaporate to dryness or directly derivatize.
4. Derivatization: follow AccQ-Tag kit protocol (borate buffer + AQC reagent, 10 min at room temp).
5. Dilute with mobile phase, inject to RP-UPLC (C18) or HILIC depending on method.

LC-MS 조건(권장)

• Column: UPLC BEH C18 2.1×50 mm, 1.7 μm
• Mobile A: water + 0.1% FA; B: ACN + 0.1% FA
• ESI(+) MRM on each AQC derivative → internal standard quant.

대안: 비유도체 HILIC

• HILIC with ammonium formate buffer allows direct measurement without derivatization, 장점은 간단성, 단점은 sensitivity 및 ion suppression.

C. Ketone bodies (BHB, AcAc, acetone) — 권장: LC-MS/MS (BHB via direct quant; AcAc derivatize or enzymatic backup)

특성

• Acetoacetate(AcAc)는 비교적 불안정(분해되기 쉬움) → 처리·보관 중요
• β-hydroxybutyrate(BHB)는 비교적 안정, 정량이 더 쉬움
• Acetone은 휘발성, headspace 분석(GC-MS)로 측정하는 경우가 많음

전처리 SOP (blood/plasma)

1. Thaw on ice. Aliquot 50–100 μL plasma → add IS (13C4-BHB, 13C4-AcAc if available).
2. PPT: add MeOH, vortex, centrifuge → collect supernatant.
3. For AcAc: immediate derivatization (e.g., with 3-NPH or pentafluorobenzyl bromide (PFBBr) for GC) to stabilize.
4. BHB: direct LC-MS/MS quant OK (ion pairing or HILIC depending on separation).
5. Inject.

LC-MS 옵션

• Direct BHB: HILIC or RP after ion pairing (though ion pairing is less LC-MS friendly)
• Derivatized AcAc: derivatize to stable hydrazone (3-NPH) and measure as for SCFA (because AcAc is a β-ketoacid)
• Acetone: consider headspace-GC-MS for best sensitivity; or derivatize (PFBBr) for GC-MS.

Enzymatic alternative

• Clinical labs often use enzymatic assays (colorimetric/photometric) for BHB due to throughput and low cost; but multiplex LC-MS gives broader metabolite panel.

5) 내부표준(IS) 전략 및 캘리브레이션

내부표준 권장

• 동위원소 표지(¹³C, ²H) 내부표준(ILIS) 을 각 analyte별로 사용하는 것이 최선.
• 최소한 class-level IS: e.g., 13C2-acetate (for SCFA), 13C6-leucine (for BCAA), 13C4-BHB (for BHB).
• ILIS 농도는 QC mid-level과 유사한 신호 범위가 되게 조정.

캘리브레이션

• Matrix-matched calibration 권장 (특히 plasma/serum).
• 만약 matrix가 복잡(대변 등)하거나 표준품이 부족하면 standard addition을 고려.
• Calibration 범위: LLOQ는 임상/연구 필요에 따라 설정 (예: acetate plasma LLOQ 1–5 μM 등 실제 범위 참고).
• Curve fit: weighted (1/x 또는 1/x²) 사용 권장.

Matrix effect 평가

• Post-extraction spiking (matrix factor, IS-normalized MF) 실험 필수 (n≥6 lots).
• MF 허용: IS-normalized MF within 0.85–1.15 권장.

6) 안정성·보관·샘플링 주의사항

• Freeze-thaw: 대부분 SCFA/BCAA/BHB는 ≤ 3 cycles 권장; AcAc는 더 불안정.
• Bench-top: room temp 노출 최소화(특히 AcAc, acetone).
• Acidification: fecal SCFA는 산성화(HCl)로 안정화 가능. Plasma에 산성화는 analyte 회수 영향 있으니 검증 필요.
• Anticoagulant: EDTA 권장(일관성 확보). NaF 포함 튜브는 glycolysis 억제(대사체 영향) 때문에 주의.
• Microbial activity: 장내/소변 샘플은 실온 보관시 미생물 대사로 SCFA 변화 가능 → 즉시 냉동.

7) Validation 항목

• Selectivity/Specificity (blank matrix n≥6)
• LLOQ 및 LOD (signal-to-noise ≥10 for LLOQ)
• Accuracy & Precision (intra/inter-day; QC L/M/H n=5) — criteria: accuracy ±15% (±20% at LLOQ), precision CV ≤15% (≤20% at LLOQ)
• Matrix effect & Recovery (post- and pre-extraction spikes)
• Carryover (<20% of LLOQ signal)
• Stability: short-term (bench), autosampler, freeze-thaw (3 cycles), long-term (−80°C, e.g., 3 months)
• Dilution integrity
• ISR (incurred sample reanalysis, acceptance ≥67%)

8) QC 계획 및 런 모니터링

• QC set in each run: Blank, Zero, Cal standards, QC-L, QC-M, QC-H (n≥3 each in batch with ≤100 injections).
• System suitability sample at start and end (compound mix + ILIS) — monitor retention time, area, IS area.
• Trend monitoring: plot IS area, RT, peak shape vs injection number. Set alert thresholds (e.g., IS area drop >15%, RT shift >0.05 min).
• Carryover test: high conc → blank injection after; acceptance blank <20% LLOQ.

9) 문제해결 체크리스트

A. Signal이 갑자기 떨어질 때

• IS 신호 확인 → source contamination? → source clean
• Column aging(peak tailing) → flush or replace
• Mobile phase prep error → prepare fresh batches

B. High matrix effect (suppression)

• Try phospholipid removal plate for plasma
• Dilution approach (if sensitivity 허용)
• Change chromatography (shift RT away from phospholipid elution)
• Use ILIS for compensation

C. AcAc 불안정성으로 인한 불일치

• 즉시 derivatize after extraction or acidify + freeze
• Use freshly prepared calibrators; spike IS early (pre-extraction)

D. Fecal SCFA variability

• Homogenization SOP 확립(질량/용매 비율 표준화)
• Acidify if appropriate; report dry weight normalization

10) 현실적 도입 로드맵

0–3개월: 요구사항 정의(샘플 유형, LLOQ), 시약·IS 확보, 간이 SOP 작성, 소규모 시범 데이터 수집
3–6개월: method optimization(전처리 비교: PPT vs SPE vs deriv), LC gradient 최적화, preliminary validation
6–9개월: full validation (accuracy/precision/stability/matrix effect), QC system 구축(LIMS 연동)
9–12개월: external sample set 검증(다기관), SOP 확정 및 교육, 임상 적용(파일럿)

 

• SCFA·BCAA·ketone body는 표준화가 없으면 결과 비교 불가 → 샘플 수집·전처리 표준화가 가장 먼저
• 가능하면 동위원소 내부표준(ILIS) 를 각 analyte로 도입
• SCFA는 유도체화(3-NPH) 가 감도·정량성에서 우수, feces는 산성화 고려
• BCAA는 AccQ-Tag(AQC) 유도체법 또는 HILIC direct법으로 안정적 정량
• Ketone: BHB direct (LC-MS) / AcAc 유도체화 또는 enzymatic 보조 / acetone은 headspace GC 권장
• Validation과 QC 운영을 통해 임상·비임상 의사결정에 맞는 정확한 데이터 제공

CFA(Short-Chain Fatty Acids), BCAA(Branched-Chain Amino Acids), ketone bodies(β-hydroxybutyrate,acetoacetate, acetone) 분석법 표준화(standardization)