LC–Ion Mobility MS(IM-MS)를 활용한 Isomer 분리 전략

 제약 분석실에서 실질적으로 적용 가능한 기술적·운영적 접근

 

LC–Ion Mobility MS(IM-MS)를 활용한 Isomer 분리 전략

이 글에서는 최근 제약 분석 분야에서 빠르게 주목받고 있는 Ion Mobility Mass Spectrometry(IM-MS)를 기반으로 isomer 분리 전략을 실제 실험실 수준에서 구현하는 방법을 중심으로 정리해 보았다.
특히, 이 글은 단순 장비 소개나 이론적 배경보다는 LC-MS/MS 실무자의 관점에서 IM-MS가 isomer 문제를 어떻게 현실적으로 해결하는가, 그리고 국내 제약사 연구소에서 적용 시 고려해야 할 조건, 한계, workflow 설계 기준을 중심으로 다룬다.

1. 왜 지금 이 시점에 “IM-MS 기반 isomer 분리”인가?

1) 기존 LC-MS/MS로 해결되지 않는 문제

제약 분석실에서 가장 흔한 난제 중 하나는 다음과 같다.

• 동일 m/z, 동일 fragmentation pattern
• LC 상에서도 거의 동일 retention
• 반응모드 전환(MRM 전이 변경)으로도 구분되지 않음

즉, 구조 이성질체(isomer) 또는 입체 이성질체(stereoisomer) 문제다.

이런 문제는 특히 다음 상황에서 많이 발생한다.

 

분야	Isomer 문제 빈도
신약 후보물질 대사체 동정 (Phase I oxidative metabolites)	매우 높음
약물 분해산물 분석 (stability-indicating method)	높음
Metabolomics untargeted profiling	매우 높음
Chiral compound 개발	높음
Lipidomics · Glycomics	극도로 높음

LC-MS/MS만으로는 isomer를 완전히 분리하기 어려운 경우가 많은데, IM-MS는 이 영역에서 거의 유일한 게임체인저로 평가받는다.

2. LC-IM-MS의 기본 원리와 isomer 분리의 핵심 지표 “CCS”

1) IM-MS의 요소

IM-MS는 크게 다음 요소로 구성된다.

1. LC (pre-separation)
2. Ionization (ESI/Nano-ESI)
3. Ion mobility cell
   • Drift Tube (DTIMS)
   • Traveling Wave (TWIMS)
   • Trapped Ion Mobility (TIMS)
   • FAIMS
4. Mass Analyzer(TOF or Orbitrap)

2) Isomer 분리의 핵심 지표: Collision Cross Section(CCS)

각 이온은 mobility cell 안에서 전기장 하에서 이동하는 속도가 다르다. 이 속도는 3차원적 분자 구조, 전하 분포, 고유 입체적 면적에 따라 달라지며, 이는 CCS(Ų) 값으로 표현된다.

Isomer는 m/z는 동일하지만 CCS는 다르다.
→ 따라서 IM-MS에서는 LC에서 분리되지 않는 이성질체도 분리가 가능해진다.

3) IM-MS가 isomer 분리에 강한 이유

• 구조가 조금만 달라도 mobility에서 drift time 차이가 발생
• 특히 ortho/meta/para aromatic isomer 분리에서 큰 효과
• cis/trans, diastereomer 분리에 매우 강함
• IM dimension이 추가되면서 2D-separation이 LC보다 훨씬 강력

3. IM-MS 기술 유형별 Isomer 분리 성능 비교

1) DTIMS (Drift Tube Ion Mobility)

• 가장 직관적, 물리적으로 CCS 계산 가능
• isomer 분리 성능 매우 우수
• 대신 장비 유지보수 비용과 분석 시간 증가 단점

2) TWIMS (Traveling Wave)

• Waters에서 많이 사용
• CCS absolute 계산은 calibration 필요
• isomer 분리 성능은 DTIMS 대비 약간 낮을 수 있음
• High-throughput 분석에 적합

3) TIMS (Trapped IM)

• Bruker timsTOF 시리즈
• 현재 가장 폭발적으로 성장
• PASEF(PaSER enabling MS/MS acquisition)와 결합하면 metabolomics 최고 수준
• 입체 이성질체 분리에 매우 뛰어남

4) FAIMS

• 저-분해능 MS와 결합해도 isomer filtering 가능
• 분리력은 TIMS·DTIM 대비 떨어지지만 noise reduction 효과 탁월
• Bioanalysis(혈장 샘플)에서 matrix interference 제거 위주로 활용

4. 제약 분석 분야에서 IM-MS 기반 Isomer 분리 활용 분야

1) 약물 대사체 동정 (Biotransformation profiling)

Phase I/II 대사체 중 많은 종류가 isomeric metabolites이다.

예:

• hydroxylation (C-OH) 위치가 다른 isomer
• O-demethylation vs N-demethylation
• Glucuronidation positional isomers

LC-MS/MS로는 retention이 거의 동일할 수 있으나 IM-MS에서는 CCS 차이가 명확히 나타난다.

2) Stability-indicating method에서의 Unknown degradant 분리

실제 국내 제약사 분석팀에서 고난도 과제로 자주 등장하는데,

• stress test(heat, peroxide, humidity) 후
• 주성분과 거의 동일 RT 패턴
• fragment도 비슷함

이때 IM dimension을 추가하면 RT x DT x m/z 3차원 분리로 unknown degradant를 분리 가능.

3) Metabolomics – 특히 lipidomics

Lipidomics는 IM-MS 없는 분석은 사실상 불가능에 가까울 정도다.

특히 TAG, DAG 클래스는

• acyl-chain position isomer
• cis/trans
  구분이 LC로는 절대 불가하다.

IM-MS는 이러한 isomer 분리에 거의 필수적이다.

4) Glycan/Glycopeptide 분석

IM-MS는 glycan 구조 동정의 핵심 툴로 자리 잡고 있다.

• branching pattern
• linkage
• monosaccharide order

등이 CCS에 직접 영향을 미치기 때문이다.

5. LC-IM-MS 기반 Isomer 분리 Workflow 설계: 실무 중심 가이드

다음은 실제 국내 제약사 LC-MS 분석팀에서 IM-MS 기반 isomer 분리를 도입할 때 사용하는 전형적인 workflow이다.

Step 1. 후보 isomer 의심 peak 선정

보통 다음과 같은 경우 isomer 가능성이 매우 높다.

• 동일 m/z에서 peaks splittings 발생
• product ion scan 결과가 거의 동일
• LC gradient 변화에도 RT separation 불가
• method transfer 과정에서 RT shifting 발생
• stress test 후 새로운 peak가 생겼지만 fragmentation은 같음

Step 2: LC 조건 단순화 (IM resolution 확보 목적)

IM separation은 LC separation과 독립적이기 때문에, LC 조건을 간소화할수록 좋은 경우가 많다.

• gradient shallow → moderate로 변경
• column length 축소
• column pore size 및 particle 변화
• 이동상 organic 비율 증가로 peak compression 유도

LC resolution을 너무 좋게 만드는 것은 IM separation 능력을 오히려 감춘다.
따라서 IM 분석 시에는 “LC separation 최소화 + IM 분리 최대화”를 고려해야 한다.

Step 3: IM parameter tuning

IM-MS 분리는 mobility gas, voltage, wave height 등 다양한 파라미터에 따라 결정된다.

Parameter영향

 

Isomer 문제 빈도	영향
Drift gas (N₂/He)	CCS 분리력 핵심
Wave height / velocity (TWIMS)	isomer separation 민감
TIMS ramp	기울기 변화가 CCS 분리를 좌우
FAIMS CV	selective filtering

초기 세팅 시 가장 먼저 수행해야 할 작업은:

1. drift gas pressure scanning
2. ESI spray 조건 안정화
3. fragment energy 최소화(precursor 안정화 위해)

Step 4. CCS library 구축 및 비교

IM-MS 분석의 힘은 결국 CCS 값 비교에 의해 완성된다.

대조 표준(reference standard)이 있을 경우:

• CCS tolerance <2% 수준이면 isomer match로 판단

표준이 없는 경우에는 CCS modeling 데이터를 활용한다.

Step 5. MS/MS 기반 구조 동정 병행

IM-MS만으로 isomer 구조를 완전히 판단할 수는 없다.
반드시 아래와 조합해야 한다.

• Multi-stage MSⁿ
• UV/IR spectroscopy
• Hydrogen–deuterium exchange
• In-silico fragmentation prediction

IM-MS는 구조 동정의 결정타가 아닌, “구별 수단”이라는 점이 핵심이다.

6. IM-MS 분리 성능을 높이기 위한 실무 세팅 팁

다음 내용은 해외 논문보다 국내 분석실 경험 기반으로 더 현실적인 팁을 정리한 것이다.

Tip 1. Peak width는 넓을수록 mobility separation이 잘 보인다

LC에서 overly sharp peak는 mobility에서 separation이 잘 드러나지 않는다.

→ IM separation을 하기 위해서는 적당한 LC peak width가 필요하다.

Tip 2. FAIMS는 isomer separation보다 “interference filtering”에 강하다

따라서 목적이 isomer 분리인지, matrix 제거인지 명확히 해야 한다.

Tip 3. CCS shift는 adduct type에 따라 크게 달라진다

특히 lipidomics에서 유명한 문제다.

• [M+H]⁺
• [M+Na]⁺
• [M+NH₄]⁺

adduct에 따라 CCS 값은 크게 달라질 수 있다.
실무에서는 분리 성능이 더 좋은 adduct를 선택해야 한다.

Tip 4. Ion heating 최소화

IM-MS는 ion heating에 매우 취약하다.

• source temperature
• desolvation gas temperature
• cone voltage

온도가 조금만 올라가면 CCS reproducibility가 떨어진다.

7. IM-MS 기반 isomer 분석의 제약 · 한계

1) Absolute structural identification은 불가

즉, IM-MS는 “구조가 완전히 동일한지”를 판정하는 기술이 아니라
“서로 다른 구조인지”를 판별하는 기술에 가깝다.

2) Quantitation 목적에는 부적합

IM-MS 기반 TOF/Orbitrap은 정량 정확도에서 triple quad 대비 떨어진다.

3) Routine QC 환경에 바로 도입되기 어려움

• 유지보수 어려움
• 데이터 처리량 높음
• 장비 가격 및 워크플로우 변화 필요

8. 국내 제약사 분석팀 도입 전략: 무엇부터 준비해야 하는가?

다음은 국내 연구소에서 IM-MS 도입 시 가장 현실적인 고려 요소들이다.

1) 분석팀의 실제 Pain Point 정의

도입 이유가 명확해야 한다.

• isomer 때문에 구조 동정이 안 된다
• metabolomics 연구 필요
• stability test 시 unknown peaks 해결 필요
• 기존 quad 기반 분석의 한계 해결 필요

2) LC-MS 팀 vs 대사체 팀 협업

IM-MS는 LC-MS 팀 단독으로 운영하기 어렵다.

특히 metabolomics는 통계, multivariate, feature alignment가 필수이기 때문에
데이터 사이언스 인력이 반드시 필요하다.

3) Routine triple-quad workflow와의 역할 분담

가장 많이 사용되는 모델은 다음과 같다.

 

분석 종류	적합 장비
정량(TDM, PK)	Triple quad
대사체/대사체 동정	IM-MS
분해산물 분석	IM-MS + Quadrupole-MS
제조·품질분석(QC)	Triple quad

IM-MS는 정량보다 분리·동정 중심이라는 점이 명확해야 한다.

9. LC-IM-MS 기반 Isomer 분석 체크리스트

✔ LC 조건

• Column length: too long → X
• Gradient complexity: minimal
• Peak width: moderate
• Injection solvent: 낮은 organic 비율 추천

✔ Ionization

• ESI stability 확인
• adduct type 선택
• desolvation temp 최소화

✔ Mobility

• drift gas pressure 최적화
• wave height / velocity tuning
• TIMS ramp 최적화
• FAIMS CV scanning

✔ MS/MS

• fragmentation energy 최소화
• dominant transition 확인
• isomer-sensitive neutral loss 탐색

✔ Data processing

• CCS reproducibility ±1–2% 이내
• CCS library cross-match
• RT–DT–m/z 3D plot 확인

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10. 결론: IM-MS는 “LC로는 절대 안 되는 문제”를 해결하는 도구이다

isomer 분리는 제약 분석에서 오래된 난제였고, LC 조건만 조정해서는 해결할 수 없는 경우가 압도적으로 많았다.
IM-MS는 이 문제를 근본적으로 해결하는 거의 유일한 기술이며,
특히 대사체 동정, 분해산물 분석, lipidomics, glycomics 분야에서는 사실상 필수 기술로 자리 잡았다.

국내 제약사에서도 IM-MS 도입은 빠르게 확산되고 있으며,
향후 AI 기반 CCS 예측, IM-MS 기반 digital metabolite library,
LC-IM-MS-MSⁿ 통합 플랫폼이 핵심 경쟁력이 될 것이다.