Fragmentation 조건이 identification에 미치는 영향

Fragmentation 조건이 identification에 미치는 영향

— 우리는 펩타이드를 보는 것이 아니라, 부서진 조각을 해석하고 있다

proteomics 데이터를 처음 접하면
대부분은 이렇게 생각한다.

“MS1에서 peptide를 잡고,
MS/MS에서 확인하면 되는 거 아닌가?”

이 말은 틀린 건 아니다.
하지만 중요한 한 단계가 빠져 있다.

👉 그 peptide는 우리가 직접 보는 것이 아니라,
부서진 조각을 통해 ‘추론’하는 것이라는 점이다.

그리고 그 조각을 어떻게 부수느냐가
바로 fragmentation 조건이다.

우리는 ‘존재’를 보는 것이 아니라 ‘패턴’을 본다

MS/MS에서 얻는 것은
완전한 구조 정보가 아니다.

• b-ion
• y-ion
• 일부 중성 손실
• noise

이런 조각들이 섞인 스펙트럼이다.

search algorithm은
이 패턴을 보고

👉 “이 peptide일 가능성이 높다”라고 판단한다

즉,

👉 fragmentation이 바뀌면
👉 pattern 자체가 바뀌고
👉 identification 결과도 바뀐다

fragmentation이 강하면 생기는 일

처음 method를 세팅할 때
많은 사람들이 이렇게 생각한다.

“fragmentation을 강하게 하면
더 잘 부서져서 더 많은 정보를 얻지 않을까?”

부분적으로 맞다.

collision energy를 높이면

• fragment ion 수 증가
• coverage 증가

하지만 동시에 다른 일이 일어난다.

signal이 ‘분산’된다

하나의 precursor가
너무 강하게 fragmentation되면

• fragment가 너무 많아지고
• 각 ion intensity는 낮아진다

결과

• 주요 ion이 약해짐
• noise와 구분 어려움
• score 감소

실제 상황

• moderate CE → 명확한 y-ion series
• high CE → fragment는 많지만 흐릿함

👉 정보는 많아졌지만
👉 해석은 더 어려워진다

fragmentation이 약하면 생기는 일

반대로 collision energy를 낮추면

• fragment 수 감소
• 일부 peptide는 거의 부서지지 않음

결과

• ion series 불완전
• matching 실패

실제 상황

• precursor peak는 강함
• fragment는 부족

👉 signal은 좋지만
👉 정보가 부족하다

결국 핵심은 ‘균형’이다

fragmentation의 본질은
이 한 문장으로 정리된다.

👉 충분히 부서지되, 너무 부서지지 않아야 한다

peptide마다 최적 조건이 다르다

여기서 더 복잡해진다.

모든 peptide가
같은 fragmentation 조건에 반응하지 않는다.

차이를 만드는 요소

• 길이
• 전하 상태
• 서열 (특히 proline, acidic residue)
• modification

결과

같은 collision energy에서도

• 어떤 peptide는 잘 부서지고
• 어떤 peptide는 거의 intact

👉 즉, 하나의 설정으로는
👉 모두를 최적화할 수 없다

NCE (Normalized Collision Energy)의 함정

많이 사용하는 NCE는
이 문제를 어느 정도 해결하려고 만든 개념이다.

하지만 이것도 완벽하지 않다.

문제

• 실제 fragmentation 효율은
  → m/z, charge, 구조에 따라 달라짐

👉 같은 NCE라도
👉 peptide마다 다른 결과

Stepped collision energy의 등장

이 문제를 해결하기 위해
많이 사용하는 전략이 있다.

👉 stepped CE

방식

• 하나의 precursor에 대해
• 여러 CE 값을 동시에 적용

장점

• 다양한 fragment 확보
• identification 확률 증가

단점

• scan time 증가
• signal 분산

👉 역시 trade-off 존재

fragmentation 방식 자체의 차이

collision energy만이 아니라
fragmentation 방식도 중요하다.

HCD

• 빠름
• broad fragment
• 일반적인 proteomics

CID

• trap 기반
• 특정 fragment bias

ETD

• modification 보존
• PTM 분석에 유리

실제 영향

같은 peptide라도

• HCD → identification 성공
• ETD → 실패 (혹은 반대)

👉 fragmentation 방식 = 해석 방식 변화

co-isolation과 fragmentation의 결합 문제

이건 실무에서 매우 중요하다.

상황

isolation window 안에
여러 peptide 존재

결과

• 동시에 fragmentation
• mixed spectrum 생성

영향

• 잘못된 peptide assignment
• false identification 증가

👉 fragmentation 조건이 강할수록
→ 혼합 효과 더 심해짐

실제 사례: 같은 peptide, 다른 결과

같은 샘플에서

• CE 25 → peptide A 확인
• CE 35 → peptide A 사라짐

이건 이상한 일이 아니다.

👉 fragmentation 패턴이 바뀌었기 때문

가장 위험한 착각

“fragmentation은 identification 이후의 문제”

많은 사람들이 이렇게 생각한다.

하지만 실제로는

👉 identification을 결정하는 핵심 단계

우리가 놓치는 이유

fragmentation은

• 자동으로 실행되고
• 숫자로만 표현되고
• raw data에서 직관적으로 보이지 않는다

그래서 우리는

👉 이 변수를 거의 의식하지 않는다

실무에서 반드시 고려해야 할 것

1) 기본 NCE 범위

• 25~35 (HCD 기준)

2) stepped CE 활용

• 복잡한 샘플에서 유리

3) peptide 특성 고려

• charge state 분포 확인

4) isolation window 관리

• co-fragmentation 최소화

5) 데이터 직접 확인

• spectrum quality 체크

핵심 정리

fragmentation은

• 단순한 “부수기”가 아니다
• 정보를 만드는 과정이다

그리고

• 어떻게 부수느냐에 따라
  👉 무엇이 존재하는지 판단이 바뀐다

결론

proteomics에서 우리는
peptide를 직접 보는 것이 아니다.

👉 부서진 흔적을 보고 추론한다

fragmentation 조건을 바꾸는 순간

• 더 정확히 보는 것이 아니라
  👉 다르게 해석하게 된다

마지막 질문

다음에 MS/MS 데이터를 볼 때
이 질문을 반드시 해야 한다.

“이 peptide는 없는 걸까,
아니면 내가 제대로 부수지 못한 걸까?”

이 질문 하나가
identification의 신뢰도를 완전히 바꾼다.