Dynamic exclusion 설정이 결과를 왜곡하는 방식

Dynamic exclusion 설정이 결과를 왜곡하는 방식

— 더 많이 보기 위한 장치가, 오히려 덜 보게 만드는 순간

처음 DDA method를 세팅할 때
dynamic exclusion은 거의 당연한 옵션처럼 들어간다.

설명도 단순하다.

“이미 선택된 precursor를 일정 시간 동안 제외해서
더 다양한 peptide를 보게 해준다”

이론적으로는 완벽해 보인다.
같은 것만 반복해서 분석하는 비효율을 줄이고,
coverage를 넓혀준다.

그래서 대부분의 경우
별 고민 없이 기본값을 사용하거나
조금 늘리거나 줄이는 정도로 끝난다.

그런데 데이터를 몇 번 반복해서 보다 보면
이 설정이 단순한 효율 문제가 아니라
결과 자체를 바꾸고 있다는 느낌이 들기 시작한다.

• 어떤 peptide는 항상 보이는데
• 어떤 peptide는 run마다 사라지고
• 특정 단백질은 예상보다 과소평가된다

이쯤 되면 질문이 생긴다.

“나는 정말 더 많이 보고 있는 걸까?”

DDA의 본질은 ‘선택’이다

dynamic exclusion을 이해하려면
먼저 DDA의 구조를 다시 봐야 한다.

DDA는 모든 것을 보는 방식이 아니다.

• MS1에서 전체 스캔
• 그 순간 가장 강한 신호 선택
• 선택된 것만 MS/MS 분석

이 과정이 계속 반복된다.

여기서 이미 중요한 특징이 드러난다.

👉 DDA는 반복적으로 같은 것을 선택하려는 성향이 있다

강한 신호는 계속 강하고,
그래서 계속 선택된다.

dynamic exclusion은 이 반복을 끊기 위해 만들어졌다

dynamic exclusion은
이 반복을 의도적으로 막는 장치다.

한 번 선택된 precursor를
일정 시간 동안 선택 목록에서 제외한다.

그 결과

• 새로운 peptide가 선택되고
• coverage가 증가한다

이건 분명한 장점이다.

하지만 문제는
이 “제외”라는 동작이
생각보다 훨씬 큰 영향을 만든다는 점이다.

exclusion은 ‘기회’를 제거한다

dynamic exclusion이 작동하는 순간
특정 precursor는 일정 시간 동안
아예 선택 대상에서 사라진다.

이건 단순히 “덜 본다”가 아니라

👉 그 시간 동안은 존재하지 않는 것과 같다

실제 상황

어떤 peptide가
10초 동안 elute된다고 가정해보자.

• 처음 2초에 선택됨
• 이후 20초 exclusion 설정

이 경우

→ 나머지 8초 동안은
→ 아무리 강한 신호여도 선택되지 않음

결과

• MS/MS 데이터는 1번만 존재
• quantification 정보 부족
• identification confidence 저하 가능

exclusion time이 길어질수록 생기는 문제

많은 사람들이
coverage를 늘리기 위해
exclusion time을 길게 설정한다.

처음에는 효과가 있는 것처럼 보인다.

• 더 다양한 peptide 검출
• protein 수 증가

하지만 어느 순간부터
이상한 현상이 나타난다.

• 중요한 peptide가 한 번만 잡힘
• replicate 간 일관성 감소
• quantification 불안정

반복 관찰의 중요성

우리는 종종 잊지만
한 번 본 것보다 여러 번 본 것이 더 신뢰할 수 있다.

특히 LC-MS에서는

• peak 전체를 따라가면서
• 여러 번 sampling해야
• 정확한 quantification이 가능하다

dynamic exclusion이 길어지면

👉 이 반복 관찰이 사라진다

실제 사례: peptide는 있는데 데이터는 부족하다

특정 peptide가

• 모든 run에서 존재하지만
• 매번 다른 시점에 한 번만 선택됨

이 경우

• identification은 가능
• quantification은 불안정

이걸 그대로 해석하면

→ variability 증가

하지만 실제로는

👉 sampling 구조 문제

너무 짧은 exclusion도 문제다

반대로 exclusion을 너무 짧게 설정하면
또 다른 문제가 발생한다.

상황

• exclusion time 매우 짧음

결과:

• 같은 peptide 반복 선택
• MS/MS 자원 낭비

결과

• high abundance peptide 과대표현
• low abundance peptide 기회 감소

결국 두 가지 왜곡이 발생한다

dynamic exclusion은
항상 두 방향으로 결과를 왜곡한다.

1) 과도한 exclusion

→ 반복 관찰 부족
→ quantification 왜곡

2) 부족한 exclusion

→ 특정 peptide 과대표현
→ coverage 왜곡

protein-level에서도 왜곡이 발생한다

이 문제는 peptide 수준에서 끝나지 않는다.

상황

단백질 X에서

• peptide A → early elution
• peptide B → late elution

exclusion 설정에 따라

• A만 선택되거나
• B만 선택되는 상황 발생

결과

→ 단백질 abundance 계산 왜곡

DDA 재현성 문제의 숨겨진 원인

많은 사람들이
DDA의 낮은 재현성을
장비 문제로 생각한다.

하지만 실제로는

👉 dynamic exclusion이 큰 역할을 한다

이유

각 run마다

• 선택 타이밍이 조금씩 다르고
• exclusion 상태도 달라진다

그 결과

→ 서로 다른 peptide가 선택됨

우리는 왜 이걸 놓치는가

이유는 간단하다.

dynamic exclusion은

• 자동으로 작동하고
• 눈에 보이지 않고
• method에 묻혀 있다

그래서 우리는

👉 이 변수를 거의 의식하지 않는다

가장 위험한 순간

데이터가 “그럴듯하게 다양해 보일 때”다.

• peptide 수 많음
• protein 수 증가

이걸 보면 우리는

→ 좋은 결과라고 생각한다

하지만 실제로는

• 반복성이 낮고
• quantification이 불안정하고
• 일부 peptide는 한 번만 관찰됨

실무에서 반드시 고려해야 할 것

1) peak width 기반 설정

exclusion time은
peak duration과 맞아야 한다

2) 반복 sampling 확보

한 peptide가 최소 2~3회 선택되도록

3) 목적 기반 설정

• discovery → 조금 길게
• quantification → 짧게

4) QC로 확인

• 반복 선택 여부
• peptide-level consistency

핵심 정리

dynamic exclusion은

• 단순한 효율 기능이 아니다
• 관찰 기회를 조절하는 변수다

그리고

• 무엇을 더 많이 볼지 뿐 아니라
  👉 무엇을 덜 보게 할지도 결정한다

결론

DDA에서 우리가 보는 데이터는
자연스럽게 얻어진 것이 아니다.

이건

👉 선택되고, 제외된 결과의 집합이다

dynamic exclusion을 바꾸는 순간

• 더 많이 보는 것이 아니라
  👉 다르게 보게 된다

 

다음에 DDA 데이터를 볼 때
이 질문을 반드시 해야 한다.

“이 peptide가 없는 걸까,
아니면 exclusion 때문에 선택되지 않은 걸까?”

이 질문 하나가
결과 해석을 완전히 바꾼다.