Multi-Quantifier Ion을 활용한 정량 정확도 향상 전략

― LC-MS/MS 정량 분석에서 ‘한 개의 Q ion에 의존하는 방식’을 넘어서

Multi-Quantifier Ion을 활용한 정량 정확도 향상 전략

LC-MS/MS 기반 정량 분석에서 가장 오래된 관습 중 하나는 단일 quantifier ion(MRM transition)에만 의존해 약물 농도를 산출하는 방식이다. 이 방식은 단순하고 실무 적용이 쉽다는 장점이 있지만, 최근 몇 년 사이 제약사 분석팀에서는 다음과 같은 문제들을 반복적으로 경험하게 되면서 결국 단일 Q ion 의존 방식의 한계를 드러내기 시작했다.

• Matrix effect가 특정 fragment만 선택적으로 억제
• Low-level quantitation에서 간헐적 peak distortion
• Lot-to-lot matrix 변화(혈장·전혈·소변·조직)에서 signal drift
• Interference 신호가 quantifier에만 겹쳐 calibration curve 기울기 변화
• Long batch(>300 injections)에서 Q ion 감도 저하

결국 많은 글로벌 CRO·제약사에서는 multi-quantifier ion 분석 전략, 즉 두 개 이상 quantifier ion을 동시에 활용하여 정량 신뢰도를 높이는 방법을 표준화하고 있다.

이 글에서는, 국내 제약사 분석팀에서도 바로 적용 가능한
Multi-quantifier ion 기반 정량 전략의 원리–설계법–검증법–SOP 활용법을 체계적으로 정리한다.

1. 왜 Multi-Quantifier가 필요한가?

1) Quantifier 하나로는 matrix effect를 설명할 수 없다

Matrix effect는 ionization의 변화이며, 이는 fragment별로 다르게 나타난다.

예:

• Q1: 340→150 (감도 우수하지만 matrix effect -20%)
• Q2: 340→120 (감도 낮지만 matrix effect 거의 없음)

기존 방식에서는 Q1 값만 기준으로 농도를 계산하기 때문에 matrix effect가 발생하면 정량 오차가 크게 증가한다.

Multi-quantifier를 사용하면 다음과 같은 방법으로 보정할 수 있다.

C=f(Q1,Q2)=w1⋅CQ1+w2⋅CQ2C = f(Q1, Q2) = w_1 \cdot C_{Q1} + w_2 \cdot C_{Q2}C=f(Q1,Q2)=w1​⋅CQ1​+w2​⋅CQ2​

여기서 가중치(w)는 각 fragment의 감도·선형성·matrix effect 안정성 기준으로 결정한다.

2) Frag-specific interference 방지

일부 matrix나 대사체는 특정 fragment ion에만 간섭을 준다.

• 혈장에서는 Q1에 특정 phospholipid가 간섭
• 조직 homogenate에서는 neutral loss fragment에 간섭
• 소변 분석에서는 polymeric peaks가 low m/z 주변에만 간섭

Quantifier 하나만 사용하면 가짜 농도로 판단하기 쉽다.
Multi-quantifier를 사용하면 두 fragment의 패턴이 불일치할 때 즉시 문제를 감지할 수 있다.

3) 장기 batch에서의 drift 보정

Quantifier는 전압·온도·capillary 오염에 따라 time-dependent signal decay가 발생할 수 있다.

• Q1은 batch 100→200 사이에서 10% 감소
• Q2는 4% 감소

이때 단일 quantifier로 정량하면 농도가 낮아지나, multi-quantifier 가중 조합으로 계산하면 drift를 평균화하여 정량 오차를 줄일 수 있다.

4) Low-level 분석에서 S/N 개선

낮은 농도에서는 특정 quantifier가 노이즈에 가려질 때가 있다.
하지만 multi-quantifier 조합에서는 두 이온 중 더 안정적인 fragment의 정보가 보완적으로 작동하여 LLOQ 근처의 정량 정확성을 높인다.

2. Multi-Quantifier 설계 원칙: 어떤 fragment를 조합해야 하는가

1) 구조적으로 독립적 분해 모드 선택

• 하나는 backbone cleavage
• 하나는 neutral loss fragment
• 하나는 side-chain fragmentation

이렇게 구조적으로 다른 경로에서 생성된 fragment를 조합하는 것이 가장 중요하다.

2) 감도 차이가 10배 이상 나지 않는 조합

Fragment 간 감도 차이가 너무 크면 low-level에서 약한 ion은 noise와 구분되지 않는다.

실무 기준:

• 주요 quantifier: 100% 기준
• 보조 quantifier: 20~80%

3) Matrix-dependent 변동성이 서로 반대 패턴인 조합

가장 좋은 조합은 다음 관계를 가진다.

• Q1은 matrix effect에 취약 (감도 높음)
• Q2는 matrix effect에 강함 (감도 낮음)

이 조합은 보정 효과가 최대가 된다.

4) Collision energy (CE) spacing 확보

CE가 너무 유사하면 같은 precursor 상태 변화에 동일하게 반응하여 redundancy만 증가한다.

CE 차이는 최소 5–7 V 확보가 이상적.

5) Transition ion mass 차이

m/z가 서로 가까우면 background interference 가능성이 증가한다.

두 fragment 사이에 20–40 Da 이상 차이가 있으면 안전하다.

3. Multi-Quantifier 기반 정량 알고리즘 설계 방법

Multi-quantifier 전략을 실무에 적용하기 위해서는 계산 방식(algorithm)을 선택해야 한다.
대표적인 3가지 모델이 존재한다.

3.1 Weighted Average Model(가장 많이 쓰이는 방식)

C=w1⋅CQ1+w2⋅CQ2C = w_1 \cdot C_{Q1} + w_2 \cdot C_{Q2}C=w1​⋅CQ1​+w2​⋅CQ2​

가중치 설정 방식:

1. 각 Q ion의 CV
2. matrix effect 변화 폭
3. sensitivity stability
4. QC accuracy 편차

가중치는 inverse variance weighting으로 구하는 것이 이상적이다.

wi=1/σi2∑i1/σi2w_i = \frac{1/\sigma_i^2}{\sum_i 1/\sigma_i^2}wi​=∑i​1/σi2​1/σi2​​

3.2 Confidence-rule 기반 Hybrid 모델

두 quantifier의 농도 차이를 비교해 조건을 만족하면 승인하는 방식.

예시:

• Q1과 Q2 농도 차이가 20% 이하일 때만 accept
• 차이가 20% 초과 → flagging 처리 → batch error 확인

DMPK와 TDM에서 mistake 검출에 매우 효과적.

3.3 Machine Learning 기반 Ion-level Ensemble Model

HRMS나 복합 프래그먼트가 많은 경우에는
Random forest, XGBoost 기반으로 다음들을 피처화하여 정량이 가능하다.

• 각 Q ion intensity
• ion ratio
• RT deviation
• peak width
• noise baseline 변화
• CE-specific pattern

이 방식은 글로벌 CRO/metabolomics 센터에서 증가 추세.

4. Multi-Quantifier의 Method Validation 기준

1) Accuracy 비교

• 단일 quantifier vs multi-quantifier
  → low, mid, high QC에서 accuracy improvement 확인
  (보통 ±10% → ±3~5%로 개선)

2) Precision 비교

CV 감소가 validation 성공의 핵심.

실무 기준:

• 단일 Q 기반 precision: 6–10%
• Multi-quantifier 적용 precision: 3–6% 수준으로 개선

3) Selectivity 검증

• Plasma 6 lot
• Urine 6 lot
• Hemolyzed/ lipemic matrix
• tissue homogenate 등에서 interference 확인

Multi-quantifier는 selectivity 문제 발생 시 자동 경고가 가능하다.

4) Stability test

Quantifier 간 drift 패턴이 30일 내 일정한지 확인.
CE 변동 영향도 체크.

5. Multi-Quantifier를 활용한 ion ratio QC 관리

정량값 외에도 ion ratio(Q1/Q2 intensity ratio)는 품질 관리 지표로 매우 유용하다.

5.1 Acceptance Range 설정

Global 제약사 기준:

±20%(Q1/Q2)\pm 20\% (Q1/Q2)±20%(Q1/Q2)

Matrix가 복잡할수록 ±25%까지 허용한다.

5.2 Ion ratio drift 발생 시 조치

변화 양상	원인	해결
Q1만 감소	matrix effect	CE·cone voltage 조정
Q2만 감소	fragment stability 저하	collision gas 점검
Q1·Q2 모두 감소	ionization 문제	spray, source cleaning

 

6. Multi-Quantifier 기반 Batch Monitoring 전략

대규모 PK/TK batch에서 multi-quantifier는 신뢰도를 비약적으로 올려준다.

모니터링 지표:

• quantifier별 area trend
• Q1–Q2 ratio trend
• QC accuracy (Q1 vs Q2)
• drift compensation factor
• injection number vs signal decay slope

이 정보로 batch가 끝나기도 전에 오류를 탐지할 수 있다.

7. Matrix별 Multi-Quantifier 최적 활용법

1) Plasma/Serum

• phospholipid interference 빈번
• Q1(QqL transition) + Q2(structure-specific fragment) 조합 추천
• CE spacing 최소 7 V

2) Whole Blood

• polymeric background 증가
• low m/z 간섭 심하므로 higher m/z fragment 포함

3) Urine

• endogenous noise 적음 → 감도 최대 활용
• 하지만 polymeric interference → neutral loss fragment 주의

4) Tissue Homogenate

가장 복잡한 matrix.
Multi-quantifier 활용 가치가 가장 큰 영역.

• Q1: sensitivity
• Q2: stability
• Q3(optional): matrix effect robust fragment

→ 3-quantifier 조합까지도 고려 가능.

8. Triple Quad vs HRMS에서의 Multi-Quantifier 활용 차이

Triple Quad

• MRM 기반 정량
• Multi-quantifier는 2개 조합이 가장 실용적
• drift stability 모니터링에 매우 효과적
• TDM·DMPK·생동성시험 정량에서 높은 효율

HRMS

• PRM 기반에서 multi-fragment 병렬 측정
• fragment 다양성↑ → multi-quantifier의 효과 더 커짐
• untargeted→targeted 전환 workflow에 이상적

9. Multi-Quantifier 적용 시 발생하는 문제와 해결법

 

문제	원인	해결
Fragment 간 noise imbalance	CE 설정 부적절	CE optimization 반복
Ion ratio variability ↑	matrix effect 변화	weighting 재조정
Low-level에서 Q2 신호 불안정	감도 부족	sensitivity 20% 이상 확보된 fragment만 사용
Calibration curve mis-fit	fragment별 linearity 차이	non-linear model 고려

 

10. 국내 제약사 분석팀 실무자를 위한 Multi-Quantifier 적용 체크리스트

✓ Method Development 단계

• 주요 fragment 3개 이상 확보
• 구조적으로 독립된 fragment 선정
• 감도 20–100% 범위 조합
• CE spacing 5–10 V
• Matrix 6 lot에서 fragment별 ME 측정
• Ion ratio acceptance range 설정

✓ Validation 단계

• Accuracy·Precision 비교표 작성
• Selectivity 재확인
• Long batch drift 분석(Q1 vs Q2)
• Ion ratio QC 적용

✓ Routine 분석 단계

• QC sample에서 Q1·Q2·ratio 모두 모니터링
• injection number vs signal trend 확인
• drift 발생 시 fragment별 sensitivity slope 분석
• 필요 시 weighting factor 자동 업데이트

11. Multi-Quantifier 전략의 미래: AI 기반 자동 weighting

AI 모델을 사용하면 batch 실시간 데이터를 기반으로 quantifier 조합의 최적 가중치를 자동 업데이트할 수 있다.

예:

• noise 증가 시 귀약한 fragment 비중 감소
• matrix effect 강한 fragment 자동 감지
• drift 발생 시 보조 fragment weighting 증가
• RT deviation 발생 시 fragment별 신뢰도 조절

이는 향후 LC-MS/MS 정량 SOP의 큰 변화를 이끌 기술이다.

결론

단일 quantifier 기반 정량 방식은 단순하고 편하지만,
현대 제약 분석 환경에서는 정확성·재현성 측면에서 이미 한계에 도달했다.

반면 multi-quantifier ion 전략은

• matrix effect 보정
• interference 식별
• drift 감소
• low-level 정확성 향상
• batch QC 강력해짐

등 수많은 장점을 제공하며,
이미 글로벌 기업들의 표준이 되고 있다.

국내 제약사 분석팀에서도
이 전략을 도입하면 정량 정확도는 체감적으로 향상되고
특히 생동성·DMPK·TDM 분야에서 분석 신뢰도가 크게 향상될 것이다.