Myeloid-derived Suppressor Cell (MDSC) 대사체 분석

Myeloid-derived Suppressor Cell (MDSC) 대사체 분석

 

1. 배경: MDSC의 면역억제 기전과 대사 가설

1.1 MDSC 개요

• MDSC는 골수 유래 이형성 세포군으로, 호중구형(Granulocytic/PMN-MDSC)과 단핵구형(Monocytic/M-MDSC)으로 분류됩니다.
• 암환자·염증 모델에서 빈번히 증가하며, T 세포와 NK 세포 기능 억제, Treg 유도, 항원제시세포 기능 저해 등을 통해 면역 감시를 회피하게 합니다.

1.2 알려진 면역억제 기전(대사적 관점)

• 아르기닌 분해 (Arginase-1, ARG1): 아르기닌 고갈 → T 세포의 CD3ζ 발현 저하 및 증식 억제.
• 질소산화물(NO) 생산 (iNOS): NO 및 peroxynitrite 생성 → TCR 신호 손상, 단백질 니트로실화.
• 트립토판 대사 (IDO/TDO 경로 → Kynurenine): Kyn 축적 → AhR 활성화로 Treg 유도/면역억제.
• 대사 경쟁: 포도당·글루타민 등을 둘러싼 경쟁으로 effector T cell 기능 저하.
• 지질대사 변화: 지방산 산화(FAO) 의존성 증가 → MDSC의 생존·억제기능 유지.
• ROS 생성: 산화스트레스 매개 면역 억제.

이 중 어느 경로가 지배적인지는 모델(종류/종/장기)과 MDSC 아형에 따라 달라집니다. 대사체 분석은 이들 경로의 “종결 산물”을 직접 측정해 기능적 연결고리를 제시할 수 있습니다.

2. 연구 질문 설정(가설 수립)

MDSC 대사체 분석을 시작하기 전 핵심 가설을 명확히 합니다. 예:

1. 종양 유래 MDSC는 정상 골수 유래 단핵구보다 arginine catabolism (L-ornithine, urea 증가) 이 활성화되어 T 세포 억제를 유발한다.
2. PMN-MDSC는 ROS/NO 대사체(정확한 대사 산물 지표) 에서 특징적 패턴을 보인다.
3. 종양 모델에서 MDSC의 lipid accumulation (acyl-carnitine, free fatty acid) 이 FAO 의존성을 반영한다.
4. 치료(예: 항암제, 면역관문억제제) 전후 MDSC 대사체 변화가 치료 반응/내성과 연관된다.

가설에 따라 타깃 패널(L-amino acids, acyl-carnitines, bile acids, eicosanoids, redox metabolites 등)과 시료(세포/타액/혈장/종양조직)를 결정합니다.

3. 실험 설계(Practical experimental design)

3.1 모델 선택

• In vitro: 골수 유래 MDSC 유도(예: GM-CSF ± IL-6), 종양세포 conditioned media 처리. 장점: 컨트롤 용이, 시약 처리 실험 가능.
• In vivo: 종양이식 마우스(예: 4T1, LLC) 또는 환자 유래 샘플(TIL, PBMC). 인체 샘플은 이식 모델보다 파편화·변이성 높음.
• 임상 코호트: 혈중 MDSC 비율과 대사체 패턴의 상관 분석(치료 전·후 샘플링 필수).

3.2 타임포인트

• 치료 전 baseline, 치료 후 조기(24–72h), 중기(1–2주), 후기(완치/진행) 등 시계열 샘플링 권장. 대사 변화의 선후 관계 파악(원인성 증강).

3.3 표준화

• 모든 샘플은 일관된 채취법·처리시간·처리온도·freeze-thaw 제한으로 표준화합니다. 대사체는 매우 민감하므로 채취→quench(예: ice-cold methanol)→즉시 냉동이 필수입니다.

3.4 대조군

• 건강 대조, 종양 비유래 골수세포, 동종 처리된 비-MDSC(예: monocytes) 포함.

4. MDSC 분리 및 시료 준비

4.1 세포 분리

• PBMC/MDSC 분리: Ficoll density gradient → magnetic bead sorting(MACS) 또는 flow cytometry sorting(FACS).
  • 인간: Lin− HLA-DRlow/− CD11b+ CD33+ 등 표지 사용 (M-MDSC/PMN-MDSC 마커 조합).
  • 마우스: CD11b+ Gr1+ (Ly6C/Ly6G 구분).
• 정밀도: FACS로 아형(예: Ly6C^hi Ly6G− M-MDSC vs Ly6G+ PMN-MDSC) 분리 권장(순도 ≥95% 목표).

실무 팁: FACS 수집 버퍼는 0.5% BSA in PBS 등 비흡착성으로, 대사체 분석용 샘플의 경우 수분·배지 오염을 최소화하도록 PBS로 빠르게 세척한 뒤 즉시 quench 하세요.

4.2 세포 quench 및 대사체 추출 (권장 프로토콜)

1. 분리 즉시 세포 pellet을 4°C PBS로 1회 세척(가능하면 0.9% NaCl buffer 피함).
2. 가능한 빨리(≤1 min) 세포에 ice-cold 80% methanol (-80°C prechilled)을 가해 quench 하고 vortex.
3. Lysate를 4°C에서 원심분리(13,000g, 10 min). 상층액 수거(대사체 추출물).
4. 필요시 상층액을 건조(순열 증발, speedvac) 후 reconstitute (HILIC 용 solvent or 0.1% formic acid in water/MeOH mix).
5. 내부표준 (stable isotope labeled metabolites) 첨가해 회수율 보정.

실무 팁: 세포 수를 정확히 기록(예: 1×10^6 cells/sample). 세포 수 기준으로 농도 보정(normalize to cell count 또는 protein content). 세포 단위 표준화는 비교 시 필수입니다.

 

5. 분석 플랫폼 설계 (LC-MS/MS 중심)

MDSC 대사체는 매우 다양하므로 targeted approach를 기본으로 하되 필요시 untargeted HRMS를 병행합니다.

5.1 타깃 패널 추천

• 아미노산/아미노산 대사: L-arginine, L-ornithine, citrulline, glutamine, glutamate, tryptophan, kynurenine, serotonin 대사 산물.
• nitrogen/redox metabolites: nitrate/nitrite, S-nitrosothiols, glutathione(GSH/GSSG) ratio, NAD+/NADH.
• 에너지 대사/TCA intermediates: citrate, isocitrate, α-KG, succinate, fumarate, malate, lactate, pyruvate.
• 지질/FAO 관련: free fatty acids, acyl-carnitines (short/long chain), lysophospholipids, eicosanoids(프로스타글란딘, 류코트리엔).
• oxylipins/inflammatory lipids: 12-HETE, 15-HETE, PGE2 (MDSC-mediated 면역 조절관련).
• 신호 분자: adenosine, AMP/ATP ratio.

5.2 LC 분리 전략

• Polar metabolites (amino acids, TCA): HILIC or ion-pair chromatography.
• Lipids/FAO/acyl-carnitines: reverse-phase LC (C18, C30) 혹은 HILIC for acyl-carnitines.
• Eicosanoids/oxylipins: SPE 정제 후 RP-LC (긴 gradient, low carryover).

5.3 MS 조건

• Triple quadrupole (QQQ) in MRM mode for targeted quantification (sensitivity/선형성 우수).
• HRMS (Q-TOF/Orbitrap) for untargeted profiling, 구조 동정(MS/MS spectral matching).
• Ionization: ESI(+) 또는 ESI(−) 선택, lipid/oxylipin은 negative mode 유리한 경우 많음.

5.4 QC 및 validation

• SIL-IS (동위원소 표지) 각 클래스별(아미노산, acyl-carnitine, bile acid 등) 최소 1개 이상 첨가.
• Calibration curve (matrix matched) 및 3수준 QC(저/중/고).
• ISR(incurred sample reanalysis)을 포함한 반복성 검증.
• Carry-over, matrix effect, recovery 평가 필수.

실무 팁: ROS 관련 대사체(글루타치온, GSSG)는 산화에 민감해 샘플 채취→추출 시간을 단축하고 환원제(예: N-ethylmaleimide) 전처리 검토.

 

6. 보조 분석(Complementary assays)

대사체 결과만으로 기능을 확정하기 어렵기 때문에 반드시 기능 검증을 병행합니다.

• Enzyme assay / Western blot / qPCR: ARG1, iNOS, IDO1, CPT1A, PGC-1α 등 발현·활성 확인.
• Flow cytometry: MDSC phenotype (CD11b, Gr1, Ly6C/Ly6G 등), ROS (DCFDA), mitochondrial mass( MitoTracker ), fatty acid uptake(BODIPY) 측정.
• Extracellular flux analysis (Seahorse): OCR/ECAR 측정으로 OXPHOS vs glycolysis 의존성 확인.
• Functional suppression assay: MDSC와 CFSE-labeled T cell 공배양에서 T cell 증식/IFN-γ 분비 억제력 측정.

7. 데이터 처리 및 통계 해석

7.1 전처리

• 내부표준 보정 → cell-count normalization → 로그 변환 → batch correction (pooled QC 기반 LOESS 또는 ComBat).

7.2 기초 통계

• 그룹 간 비교: t-test/ANOVA (정규), Mann-Whitney/Kruskal-Wallis (비정규). FDR 보정(BH) 적용.
• 상관분석: Spearman/partial correlation (공변량: tumor burden, treatment, age 등).

7.3 다변량/네트워크

• PCA/PLS-DA: 전체 패턴 시각화(주의: overfitting 주의).
• WGCNA: 대사체 모듈과 기능성 지표(arginase activity, ROS) 매핑.
• Pathway enrichment: KEGG/MetaboAnalyst를 통한 경로 수준 해석.

7.4 통합(omics integration)

• Proteomics/transcriptomics(예: ARG1, IDO1 발현)와 대사체를 multi-omics 통합하여 인과적 가설(suspected causal chain)을 제안.
• 예: ARG1 mRNA↑ → ornithine↑ 및 arginine↓ → T cell suppression correlation 확인.

8. 실제 발견 예시(가상의 데이터 기반 사례)

아래는 한가지 가상 연구 시나리오와 결과 요약(예시)입니다.

8.1 실험: 4T1 마우스 종양 모델

• 시간점: tumor day 14 (late), day7 (early)
• 샘플: tumor-infiltrating MDSC (FACS sorted Ly6G+ Ly6Clo PMN-MDSC vs Ly6Chi Ly6G− M-MDSC), splenic MDSC, control monocytes.
• 분석: targeted LC-MS/MS (arginine family, TCA, acyl-carnitines, GSH/GSSG, kynurenine), Seahorse, ARG1/iNOS qPCR, T cell suppression assay.

8.2 가상 결과(요약)

• MDSC (tumor-infiltrating)에서 arginine↓, ornithine↑, urea↑ (ARG1 활성 지표) — T cell proliferation inverse correlation (r=−0.78, p<0.001).
• Kynurenine↑ (IDO1 관련) — Treg frequency 증가와 양의 상관.
• Long-chain acyl-carnitine(C16, C18) ↑ — Seahorse에서 basal OCR 높음(FAO 의존성), FAO 억제 시 MDSC survival·suppressive function 감소.
• GSH/GSSG ratio 감소 & ROS↑ — ROS scavenger 처리 (NAC) 시 T cell 억제 완화.

해석: MDSC는 tumor microenvironment에서 ARG1, IDO1, FAO 및 ROS 기반 면역억제 네트워크를 동시에 가동하며, 치료 타깃(arginase inhibitor, IDO inhibitor, FAO inhibitor, antioxidant)을 조합하면 억제 기능을 부분적 해제할 수 있음을 시사.

 

9. 흔한 실무 문제(함정)과 해결책

1. 세포 수 적음: FACS로 순수 분리하면 세포수가 적어 대사체 신호가 약함. 해결: pooling(동일 그룹 내 병합), 보다 민감한 nano-LC 또는 HRMS 사용, targeted MRM로 감도 확보.
2. 배지 오염/항응고제 간섭: 채취·세척 버퍼의 잔존물이 분석에 영향. PBS로 충분 세척하고, 배지 잔류물을 없애기 위한 wash protocol 확립.
3. 샘플 처리 지연: 대사체는 즉시 변함. 샘플→quench 시간을 SOP로 고정(예: ≤1 min).
4. Matrix effect: lipid rich samples 에서 suppression. SIL-IS와 matrix-matched calibration 권장.
5. 결과 과해석: 상관은 인과가 아님. 반드시 functional assay(Seahorse, suppression assay)로 검증.

10. 임상적·약물 개발적 시사점

• Biomarker 개발: 혈중 MDSC 관련 대사체 패턴(arginine/ornithine ratio, kynurenine/tryptophan ratio, certain acyl-carnitines)은 ICI 반응성/내성 예측 혹은 DILI/항암제 독성 리스크 모니터링에서 유용할 수 있음.
• Targeted therapy: ARG1 inhibitor, iNOS modulator, IDO/TDO inhibitor(임상 시험 중인 약물들), FAO 억제제의 병용 전략 근거 제공.
• Treatment monitoring: 치료 전후 MDSC metabolome 변동을 통해 조기 반응성(또는 재발)을 예측하는 실시간 모니터링 가능.
• 환자 분류: MDSC 대사 프로파일로 ‘metabolic-MDSC high’ 환자를 선별하여 맞춤형 면역조절치료 적용.

11. 향후 연구 방향(권장)

1. Single-cell metabolomics: MDSC 하나하나의 대사적 이질성을 규명(현장에는 기술적 난관이 있으나 progress 중).
2. Spatial metabolomics: 종양 내 위치(침윤부 vs 중심부)에 따른 MDSC 대사 상태 차이를 MALDI-MSI 등으로 분석.
3. Longitudinal human cohort: 치료 전·중·후 MDSC metabolome 변화와 임상 outcome 연계(대규모 다기관 연구).
4. Multi-omics causal modeling: transcriptome/proteome/epigenome + metabolome 결합으로 MDSC 면역억제 네트워크 인과 추론.
5. Interventional trials: FAO/arginase/IDO inhibitors + ICI 병용 임상에서 MDSC metabolome 변화를 surrogate endpoint로 사용.

12. 체크리스트

• 샘플: FACS 순도 ≥95%, cell count 기록, quench ≤1 min.
• 분석 패널: arginine family, kynurenine, TCA, acyl-carnitines, GSH/GSSG, ATP/ADP, eicosanoids.
• 내부표준: class별 SIL-IS 포함.
• QC: pooled QC every 8–10 runs, ISR 수행.
• 보조검증: ARG1/iNOS qPCR·WB, Seahorse, suppression assay, ROS assay.
• 통계: FDR 보정, partial correlation, validation cohort 준비.

13. 결론

MDSC는 면역억제의 핵심 실행자이며, 그 기능은 복합적 대사 네트워크에 의해 유지됩니다. LC-MS/MS 기반 대사체 분석은 ARG1/IDO/FAO/ROS 등 MDSC의 핵심 면역억제 기전의 직접적 증거(종결 산물)를 제공하며, 기능 검증과 통합하면 치료 표적 탐색과 바이오마커 개발에 강력한 근거를 제시합니다. 실험적 표준화(샘플링·quench·QC)와 보조 기능성 실험의 결합이 성공의 열쇠입니다.