Freeze-thaw가 proteome에 미치는 영향

Freeze-thaw가 proteome에 미치는 영향

냉동 보관만 했을 뿐인데 proteomics 결과가 달라지는 이유

Proteomics 실험을 하다 보면 freeze-thaw는 너무 익숙한 과정이 된다. 샘플을 수집한 뒤 바로 분석하지 못하는 경우가 대부분이기 때문에 일단 -80℃에 보관하고, 분석할 때 다시 꺼내 thawing한 뒤 사용한다. 임상 샘플은 물론이고 cell lysate, tissue homogenate, plasma, serum까지 거의 모든 proteomics workflow에서 freeze-thaw는 자연스럽게 반복된다.

그래서 많은 연구자들은 freeze-thaw를 단순한 보관 과정 정도로 생각한다. 얼렸다가 녹이는 과정일 뿐이며, 단백질 자체는 대부분 안정적으로 유지될 것이라고 믿는다. 실제 논문에서도 “samples were stored at -80℃ until analysis” 정도로 짧게 지나가는 경우가 많다.

하지만 proteomics raw data를 오래 보다 보면 이상한 현상이 반복적으로 나타난다. 동일 샘플인데 thaw cycle 수가 다른 경우 특정 peptide intensity만 감소하거나, 어떤 protein group은 unexpectedly 증가하고, 어떤 PTM pattern은 급격히 흔들린다. 어떤 경우에는 inflammatory pathway activation처럼 보이는 signature까지 나타난다.

처음에는 instrument variability처럼 보일 수 있다. Digestion efficiency 문제 같기도 하고, cleanup inconsistency 때문처럼 느껴질 수도 있다. 하지만 sample history를 따라가다 보면 결국 하나의 공통점이 보이기 시작한다. Freeze-thaw 횟수가 달랐다는 점이다.

그리고 이 시점에서 중요한 사실 하나를 이해하게 된다. Freeze-thaw는 단순한 “보관 이벤트”가 아니다. 실제로는 proteome structure 자체를 계속 재구성하는 physicochemical stress 과정에 가깝다. 단백질은 freezing과 thawing을 반복하면서 aggregation되고, 부분적으로 분해되며, 어떤 단백질은 선택적으로 사라지고, 어떤 peptide는 더 잘 보이게 된다.

즉 우리가 보고 있는 proteome은 원래 생물학적 상태 그대로가 아니라, freeze-thaw history를 통과한 뒤 살아남은 단백질들의 결과물일 수도 있다.

1. 단백질은 freezing 과정에서 생각보다 큰 스트레스를 받는다

많은 사람들이 freezing을 “반응을 멈추는 상태” 정도로 생각한다. 온도를 낮추면 단백질도 그대로 안정적으로 보존될 것처럼 느껴진다.

하지만 실제 freezing 과정은 단백질 입장에서 상당히 극단적인 환경 변화다.

물이 얼기 시작하면 ice crystal이 형성된다. 문제는 얼음 결정이 순수한 물 중심으로 만들어지면서, 주변 용액 안의 salt와 solute concentration이 급격히 증가한다는 점이다. 즉 단백질은 freezing 동안 국소적으로 매우 높은 ionic strength와 osmotic stress 환경에 노출된다.

이 과정에서 일부 단백질은 partial unfolding을 겪고, hydrophobic region이 노출되며 aggregation tendency가 증가한다.

특히 membrane-associated protein이나 large protein complex는 freeze-induced structural stress 영향을 크게 받는다.

즉 freezing은 단순 “정지 상태”가 아니라 protein folding landscape 자체를 흔드는 과정이다.

2. Thawing 과정은 생각보다 더 위험하다

흥미로운 것은 실제 damage 상당수가 freezing보다 thawing 과정에서 발생한다는 점이다.

온도가 올라가면서 partially unfolded protein끼리 interaction을 시작하고 aggregation이 진행된다. 특히 slow thawing에서는 단백질이 intermediate unstable state에 오래 머물게 되면서 aggregation probability가 증가한다.

실제 lysate sample을 여러 번 freeze-thaw한 뒤 centrifugation해보면 insoluble aggregate fraction이 증가하는 경우가 자주 관찰된다.

문제는 aggregation이 모든 protein에 동일하게 발생하지 않는다는 점이다. 어떤 protein은 안정적으로 유지되지만, 어떤 protein은 매우 빠르게 insoluble state로 이동한다.

결국 thawing은 proteome composition 자체를 선택적으로 바꾸기 시작한다.

3. Low abundance protein은 freeze-thaw에 더 취약하다

Freeze-thaw damage는 abundance dependence를 강하게 가진다.

High abundance protein은 일부 손실이 발생해도 여전히 measurable signal을 유지할 가능성이 높다. 하지만 low abundance protein은 작은 degradation이나 aggregation만 발생해도 detection threshold 아래로 떨어질 수 있다.

특히 signaling protein, transcription factor, cytokine-related protein은 원래 abundance가 낮은 경우가 많다.

실제 plasma proteomics에서는 albumin이나 immunoglobulin-derived peptide는 비교적 안정적으로 유지되지만, low abundance inflammatory mediator는 freeze-thaw cycle 증가에 따라 reproducibility가 급격히 떨어지는 경우가 많다.

즉 freeze-thaw는 proteome 전체를 균등하게 흔드는 것이 아니라, biologically 중요한 low abundance layer를 우선적으로 약화시킨다.

4. Protease activation이 조용히 시작된다

Freeze-thaw 과정에서 매우 흔하지만 잘 보이지 않는 문제가 하나 있다. 바로 endogenous protease activation이다.

세포나 tissue sample 안에는 원래 다양한 protease가 존재한다. 정상 상태에서는 compartmentalization이나 inhibitor balance에 의해 activity가 제한되어 있다. 하지만 freeze-thaw 과정에서는 membrane integrity가 깨지고 intracellular compartment가 붕괴되면서 protease exposure가 증가한다.

특히 thawing 동안 온도가 올라가는 짧은 시간 동안 proteolytic activity가 급격히 증가할 수 있다.

실제 repeated freeze-thaw sample에서는 특정 protein-derived peptide가 증가하면서 동시에 intact protein abundance는 감소하는 현상이 관찰된다.

문제는 이런 fragmentation pattern이 biological proteolysis처럼 보일 수도 있다는 점이다.

즉 freeze-thaw artifact가 실제 disease-associated protease activation signature처럼 해석될 위험이 있다.

5. Membrane protein은 freeze-thaw에서 특히 불안정하다

Proteomics에서 membrane protein recovery가 어려운 이유 중 하나는 freeze-thaw sensitivity 때문이다.

Membrane structure는 lipid bilayer integrity에 강하게 의존한다. Freeze-thaw 과정에서는 ice crystal formation과 osmotic stress 때문에 membrane organization 자체가 무너질 수 있다.

이 과정에서 membrane protein은 aggregation되거나 detergent extraction efficiency가 달라질 수 있다.

실제 membrane proteomics 데이터를 보면 freeze-thaw cycle 증가에 따라 transmembrane protein-derived peptide intensity가 systematic하게 감소하는 경우가 적지 않다.

특히 GPCR이나 receptor tyrosine kinase 같은 low abundance signaling membrane protein은 영향을 더 크게 받는다.

결국 freeze-thaw는 membrane-associated signaling landscape 자체를 왜곡할 수 있다.

6. PTM은 freeze-thaw에 매우 민감하다

Post-translational modification(PTM)은 freeze-thaw 영향을 특히 강하게 받는다.

예를 들어 phosphorylation state는 phosphatase activity에 의해 빠르게 변할 수 있다. Freeze-thaw 과정에서 phosphatase inhibitor effectiveness가 감소하거나 compartment disruption이 발생하면 phosphosite abundance 자체가 흔들릴 수 있다.

실제 phosphoproteomics에서는 freeze-thaw cycle 증가에 따라 특정 signaling phosphosite intensity가 급격히 감소하는 경우가 자주 관찰된다.

Acetylation이나 oxidation-sensitive modification 역시 freeze-thaw 동안 chemical instability 영향을 받을 수 있다.

즉 freeze-thaw는 단순 protein abundance만이 아니라 signaling pathway readout 자체를 바꿀 수 있다.

7. Repeated freeze-thaw는 peptide population까지 바꾼다

Proteomics에서는 결국 peptide를 측정한다. 문제는 freeze-thaw가 peptide generation pattern 자체를 바꿀 수 있다는 점이다.

일부 protein은 aggregation되어 digestion accessibility가 감소하고, 일부는 partial degradation 때문에 새로운 peptide fragment를 생성한다.

결과적으로 동일 protein에서도 peptide intensity distribution 자체가 달라진다.

실제 raw data를 보면 freeze-thaw cycle이 증가할수록 missed cleavage frequency가 증가하거나 특정 peptide만 선택적으로 감소하는 경우가 있다.

이 변화는 downstream quantification 단계에서 protein abundance alteration처럼 보일 수 있다.

즉 freeze-thaw는 digestion chemistry까지 간접적으로 흔들고 있다.

8. Freeze-thaw artifact는 biological signal처럼 보인다

이 문제가 가장 위험해지는 순간은 freeze-thaw-induced change가 biology처럼 보일 때다.

예를 들어 inflammatory sample group이 우연히 더 많은 freeze-thaw cycle을 겪었다고 가정해보자. Protease activation과 protein degradation pattern이 disease-associated inflammatory signature처럼 나타날 수 있다.

또 membrane protein recovery 감소는 signaling suppression처럼 보일 수 있다.

실제 clinical proteomics에서는 sample storage history가 PCA clustering과 pathway enrichment 결과를 지배하는 사례도 보고된다.

문제는 이런 변화가 replicate consistency를 유지할 수도 있다는 점이다. 동일 storage condition을 공유한 sample끼리는 매우 비슷한 artifact pattern을 갖기 때문이다.

즉 technical history가 매우 convincing한 biology처럼 보인다.

9. 왜 freeze-thaw 문제는 자주 과소평가되는가

가장 큰 이유는 freeze-thaw가 “당연한 과정”처럼 여겨지기 때문이다.

거의 모든 실험실이 sample freezing을 사용한다. 따라서 연구자들은 freeze-thaw를 unavoidable routine step 정도로 생각한다.

또 많은 경우 total protein concentration에는 큰 변화가 없어 보인다. 하지만 proteomics에서 중요한 것은 total mass가 아니라 어떤 protein과 peptide가 살아남았는가다.

더 큰 문제는 freeze-thaw artifact가 invisible하다는 점이다. 사라진 protein은 downstream abundance table 안에 직접 나타나지 않는다. 연구자는 최종 normalized data만 보게 된다.

결국 우리는 biological proteome을 보고 있다고 생각하지만, 실제로는 storage history를 통과한 proteome subset을 보고 있는 경우가 많다.

10. 실제 데이터에서 반드시 확인해야 하는 것들

Proteomics 데이터를 해석할 때 freeze-thaw history는 반드시 metadata로 관리해야 한다.

Sample별 freeze-thaw cycle 수, storage duration, thawing 방식, thawing temperature 같은 정보는 단순 기록이 아니라 핵심 experimental variable이다.

가능하면 aliquot storage를 사용하는 것이 좋다. Repeated freeze-thaw를 최소화해야 한다.

또 rapid thawing과 immediate processing이 중요하다. Room temperature에서 장시간 방치하면 proteolytic activity와 aggregation risk가 급격히 증가할 수 있다.

PTM-focused study에서는 phosphatase inhibitor와 protease inhibitor 관리가 특히 중요하다.

또 low abundance signaling protein이나 membrane protein 데이터를 해석할 때는 freeze-thaw sensitivity 가능성을 항상 염두에 둘 필요가 있다.

결론

Freeze-thaw는 단순한 보관 과정이 아니다. 실제로는 proteome structure와 peptide population을 계속 재구성하는 physicochemical stress 과정이다.

Ice crystal formation, osmotic stress, aggregation, protease activation, PTM instability 같은 요소들은 모두 특정 protein과 peptide를 선택적으로 변화시킨다. 결국 우리가 보는 proteome은 원래 biological state 그대로가 아니라 freeze-thaw history를 통과한 뒤 살아남은 단백질들의 결과물일 수도 있다.

이 사실을 이해하기 시작하면 이전에는 설명되지 않던 많은 현상들이 다르게 보이기 시작한다. 왜 low abundance protein이 반복적으로 사라지는지, 왜 membrane signaling pathway가 흔들리는지, 왜 phosphoproteomics reproducibility가 낮은지에 대한 답이 freeze-thaw 과정 안에 숨어 있는 경우가 생각보다 많기 때문이다.