같은 샘플인데 다른 metabolite profile이 나오는 이유

같은 샘플인데 다른 metabolite profile이 나오는 이유

같은 혈장 샘플을 두 번 분석했는데
feature 수가 달라지고, PCA 위치가 바뀌고,
심지어 주요 metabolite의 상대적 abundance까지 달라지는 경험.

이때 가장 먼저 떠오르는 질문은 이것입니다.

무엇이 바뀌었는가?

놀랍게도, 표면적으로는 아무것도 바뀌지 않은 것처럼 보입니다.

• 같은 샘플
• 같은 LC 조건
• 같은 MS 설정
• QC도 정상

그럼에도 결과는 달라집니다.

이 현상을 이해하려면
“샘플”이라는 단어를 다시 정의해야 합니다.

1️⃣ 샘플은 고정된 물질이 아니라 ‘변하는 시스템’이다

우리는 종종 샘플을 정적인 대상으로 생각합니다.
하지만 실제 생물학적 샘플은 시간에 따라 변합니다.

보관 중에도 대사 반응은 계속된다

냉동 보관 중이라도 완전히 멈추는 것은 아닙니다.

• 효소 잔존 활성
• 산화 반응
• 미생물 대사 (특히 stool, urine)
• 지질 과산화

이로 인해 동일 샘플이라도
해동 횟수, 보관 기간, 산소 노출 정도에 따라
metabolite 구성이 달라질 수 있습니다.

👉 “같은 샘플”이라는 전제가 이미 흔들립니다.

2️⃣ Freeze–thaw 횟수가 metabolome을 재구성한다

Freeze–thaw는 단순한 물리적 과정이 아닙니다.

발생하는 변화:

• 세포 잔해 파괴 → intracellular metabolite 유출
• 단백질 변성 → binding metabolite 방출
• 지질 분해 → 새로운 신호 생성

결과적으로 반복 해동된 샘플은
처음과 다른 metabolite landscape를 갖게 됩니다.

특히 untargeted에서는 이 변화가
새로운 feature로 인식됩니다.

3️⃣ 전처리 미세 차이가 profile을 바꾼다

Untargeted metabolomics에서 전처리는
단순한 준비 단계가 아니라 화학적 선택 과정입니다.

예: 단백질 침전 조건

• MeOH vs ACN
• 용매 비율
• 혼합 시간
• 온도

이 차이는 다음에 영향을 줍니다:

• 추출되는 metabolite 범위
• 지질 vs 극성 대사체 비율
• co-extracted matrix 성분

결과적으로 동일 샘플이라도
전처리 미세 차이만으로 profile이 달라집니다.

4️⃣ 이온화 환경은 매번 동일하지 않다

ESI 소스는 매우 민감한 환경입니다.

미세한 변화 요인:

• 소스 오염 상태
• capillary 온도
• spray 안정성
• mobile phase 증발 패턴
• 이전 주입 샘플의 잔류 영향

이온화 효율은 비선형적이며
co-eluting compound에 의해 달라집니다.

따라서 동일 농도의 metabolite라도
다른 날에는 다른 intensity로 검출될 수 있습니다.

👉 이는 재현성 문제가 아니라
이온화 경쟁의 동적 특성입니다.

5️⃣ Column 상태와 RT drift가 feature 인식을 바꾼다

Untargeted 분석에서 feature는
m/z와 RT 조합으로 정의됩니다.

하지만 column은 시간이 지남에 따라 변합니다.

• stationary phase degradation
• 미세 오염
• pressure 변화
• retention 특성 변화

RT drift가 발생하면:

• 동일 metabolite가 다른 feature로 인식됨
• alignment 실패
• peak splitting

결과적으로 같은 샘플에서도
다른 metabolite profile처럼 보이게 됩니다.

6️⃣ 데이터 처리 파라미터가 결과를 ‘생성’한다

많은 사람들이 간과하는 부분이지만,
untargeted metabolomics에서 profile은
raw data가 아니라 처리된 데이터입니다.

영향 요소

• peak picking threshold
• noise filtering
• alignment tolerance
• missing value 처리

이 파라미터가 달라지면:

• feature 수 변화
• intensity 변화
• 통계 결과 변화

즉, 동일 raw data라도
다른 metabolite profile이 생성될 수 있습니다.

7️⃣ Batch effect: 보이지 않는 가장 큰 변수

같은 샘플을 다른 batch에서 분석하면
결과가 달라지는 이유는 단순하지 않습니다.

Batch가 바뀌면:

• 장비 감도 상태
• 시약 lot
• 실험실 환경
• analyst 숙련도
• 장비 워밍업 상태

이 모든 것이 누적되어
profile 변화를 만들어냅니다.

특히 PCA에서 batch clustering이 나타나는 순간,
우리는 샘플 차이가 아니라 분석 조건 차이를 보고 있는 것일 수 있습니다.

8️⃣ 생물학적 시스템의 본질적 변동성

특히 임상 샘플에서는 동일 샘플처럼 보이더라도
미세한 조건 변화가 metabolome에 영향을 줍니다.

예:

• 채혈 시간
• 식이 상태
• 스트레스
• circadian rhythm

이러한 요인은 metabolite 농도를 시간 단위로 변화시킵니다.

즉, “같은 환자”라도
완전히 동일한 metabolome은 존재하지 않습니다.

9️⃣ 해석자의 선택이 profile을 바꾼다

놀랍게도, 같은 데이터라도
분석자가 다른 결론을 내릴 수 있습니다.

선택 요소:

• normalization 방법
• scaling 방식
• outlier 처리
• feature filtering 기준

이 선택은 PCA 결과와 biomarker 후보를 바꿉니다.

👉 같은 샘플, 같은 데이터, 다른 결론

이 순간 metabolite profile은
객관적 실체가 아니라 해석의 산물이 됩니다.

🔟 그렇다면 무엇이 ‘진짜’ profile인가

이 질문에 대한 명확한 답은 없습니다.

대신 우리는 질문을 바꿔야 합니다.

❌ 어떤 profile이 진짜인가
✔ 어떤 패턴이 반복되는가
✔ 어떤 해석이 조건이 바뀌어도 유지되는가

Untargeted metabolomics의 목적은
정적인 profile을 얻는 것이 아니라
생물학적 패턴을 이해하는 것입니다.

마무리: 다른 결과는 오류가 아니라 정보일 수 있다

같은 샘플에서 다른 metabolite profile이 나오는 현상은
단순한 실험 실패로 볼 수도 있습니다.

하지만 다른 관점에서 보면,
이 차이는 다음을 보여줍니다:

• 시스템의 민감도
• 분석 조건의 영향
• 생물학적 변동성
• 데이터 해석의 주관성

즉, untargeted metabolomics는
정답을 찾는 도구가 아니라
복잡성을 드러내는 도구에 가깝습니다.