샘플 보관 조건이 Metabolomics 결과를 바꿔버리는 사례

분석 전 단계에서 이미 결과는 달라지고 있을 수 있다

Metabolomics 연구를 처음 시작하면 대부분의 관심은 LC-MS 조건에 쏠린다.

어떤 컬럼을 사용할 것인가.

Gradient는 어떻게 설정할 것인가.

ESI polarity는 무엇을 선택할 것인가.

MS resolution은 얼마로 설정할 것인가.

실제로 수개월 동안 method development에 시간을 투자하는 경우도 흔하다.

하지만 경험이 쌓일수록 연구자들은 조금 다른 사실을 깨닫게 된다.

결과를 가장 크게 바꾸는 요인은 때때로 LC-MS가 아니다.

오히려 분석기가 켜지기도 전에 이미 결과가 달라져 있는 경우가 있다.

바로 샘플 보관(sample storage) 때문이다.

Metabolomics는 본질적으로 매우 불안정한 분자를 다룬다.

Proteomics에서 측정하는 단백질은 비교적 안정적이다.

반면 대사체는 전혀 다르다.

많은 대사체는:

• 수 분 내 변할 수 있고
• 효소 반응에 의해 계속 소모될 수 있으며
• 산화될 수 있고
• 광분해될 수 있고
• 용기 표면에 흡착될 수도 있다

즉 샘플 채취 순간의 상태를 그대로 유지하는 것이 생각보다 매우 어렵다.

이 때문에 실제 Metabolomics 연구에서는 생물학적 차이보다 보관 조건 차이가 더 크게 나타나는 경우도 적지 않다.

1. 채혈 후 실온 방치가 만들어내는 변화

가장 흔한 사례부터 살펴보자.

임상 연구에서 혈액을 채취한다.

채혈 후 바로 원심분리를 해야 하지만 현실은 그렇지 않다.

• 환자가 많다
• 인력이 부족하다
• 운송 시간이 필요하다

이런 이유로 혈액이 실온에 몇 시간 방치되는 경우가 있다.

문제는 이 시간 동안 혈액이 살아 있다는 점이다.

채혈관 안에서도:

• 적혈구
• 백혈구
• 혈소판

은 계속 대사 활동을 수행한다.

그 결과:

Glucose 감소

↓

Lactate 증가

↓

Pyruvate 변화

↓

Amino acid profile 변화

가 발생한다.

연구자는 질병 효과라고 생각하지만 실제로는 채혈 후 처리 시간의 차이일 수 있다.

2. Glycolysis는 생각보다 빠르다

특히 glucose 관련 대사체는 매우 민감하다.

혈액을 실온에 방치하면 세포들은 계속 glucose를 소비한다.

동시에 lactate가 생성된다.

결과적으로:

실제 생체 상태

↓

높은 glucose

낮은 lactate

였음에도

분석 시점에는

↓

낮은 glucose

높은 lactate

로 보일 수 있다.

이 변화는 수십 분~수 시간 내에 발생한다.

3. Freeze-Thaw Cycle의 영향

Metabolomics에서 반복 동결-해동은 대표적인 적이다.

샘플을:

-80°C 보관

↓

해동

↓

일부 사용

↓

재냉동

↓

재해동

과정을 반복한다고 가정하자.

이때 발생하는 문제는 단순하지 않다.

세포 파편이 남아 있다면:

• 효소 재활성화
• 산화 반응
• 분해 반응

이 일어날 수 있다.

특히:

• ATP
• NADH
• Glutathione

같은 불안정한 대사체는 큰 영향을 받는다.

4. ATP는 대표적인 희생자다

에너지 대사 연구에서 자주 발생하는 문제다.

ATP는 매우 불안정하다.

Freeze-thaw가 반복되면:

ATP

↓

ADP

↓

AMP

로 분해된다.

연구자는 이를 에너지 대사 이상으로 해석할 수 있다.

하지만 실제로는 storage artifact일 가능성이 있다.

5. Oxidative Metabolite의 변화

많은 대사체는 산소에 민감하다.

대표적인 예:

• Glutathione (GSH)
• Cysteine
• Methionine

등이다.

보관 중 산화가 진행되면:

Reduced GSH 감소

Oxidized GSSG 증가

가 나타난다.

이를 oxidative stress 증가로 해석할 수 있지만 실제로는 샘플 처리 과정에서 발생한 변화일 수 있다.

6. 빛(Light Exposure)의 영향

생각보다 간과되는 부분이다.

일부 대사체는 광분해에 매우 취약하다.

대표적으로:

• Riboflavin
• Folate
• Retinoid
• Porphyrin

계열이 있다.

투명 튜브에 장시간 노출되면 농도가 감소할 수 있다.

연구자는 비타민 대사 이상이라고 결론 내릴 수 있지만 실제 원인은 형광등일 수 있다.

7. 장기 보관(Long-term Storage)의 문제

많은 Biobank 연구는 수년간 보관된 샘플을 사용한다.

여기서 발생하는 질문이 있다.

10년 전 샘플의 metabolome은 현재도 유지될까?

일부 대사체는 비교적 안정하다.

그러나 모든 대사체가 그런 것은 아니다.

특히:

• Lipid mediator
• Oxylipin
• Eicosanoid

는 장기 저장 동안 감소할 수 있다.

8. 보관 온도 차이가 만드는 결과

실험실마다 보관 온도가 다르다.

-20°C

vs

-80°C

는 큰 차이가 없다 생각하기 쉽다.

하지만 metabolomics에서는 매우 큰 차이를 만든다.

특히:

• 유기산
• Coenzyme
• 에너지 대사체

는 -20°C에서 더 빠르게 변화할 수 있다.

9. Serum과 Plasma의 차이

흥미롭게도 보관 이전 단계에서도 차이가 발생한다.

Serum은 응고 과정을 거친다.

Plasma는 그렇지 않다.

응고 과정 동안:

• Platelet activation
• Enzyme release

가 발생한다.

따라서 동일 환자라도 serum과 plasma metabolome은 상당히 다를 수 있다.

10. Tube 종류의 영향

의외로 튜브 자체가 영향을 준다.

일부 플라스틱은:

• lipid adsorption
• hydrophobic metabolite loss

를 유발할 수 있다.

특히 저농도 지질 대사체 연구에서는 무시하기 어렵다.

11. Microbiome Metabolite 연구에서 특히 심각하다

장내 미생물 유래 대사체 연구에서는 문제가 더 커진다.

예를 들어:

• SCFA
• Indole derivative
• Bile acid

등은 매우 민감하다.

채취 후 처리 시간이 조금만 달라져도 농도가 크게 변할 수 있다.

12. 실제 임상 연구에서 발생한 사례

대규모 코호트 연구에서는 종종:

병원 A

↓

채혈 후 즉시 처리

병원 B

↓

2시간 후 처리

와 같은 차이가 존재한다.

이 경우 PCA를 수행하면 질병군과 대조군이 아니라 병원별로 클러스터링되는 경우도 있다.

즉 biological signal보다 pre-analytical signal이 더 강해지는 것이다.

13. QC Sample이 중요한 이유

그래서 metabolomics에서는 QC가 필수다.

QC sample을 통해:

• instrument drift
• storage effect
• batch effect

를 모니터링할 수 있다.

하지만 QC조차 storage artifact를 완전히 제거하지는 못한다.

14. Metabolomics에서 가장 위험한 착각

많은 연구자는 다음과 같이 생각한다.

"샘플만 냉동해 두면 안전하다."

실제로는 그렇지 않다.

냉동은 변화를 늦출 뿐이다.

완전히 멈추지는 못한다.

그리고 채취 직후부터 발생한 변화는 냉동으로 되돌릴 수 없다.

15. 실무적으로 권장되는 전략

Metabolomics 연구에서는 다음이 중요하다.

채취 후 즉시 처리

가능하면 수십 분 이내 분리.

Freeze-thaw 최소화

Aliquot 보관 권장.

-80°C 이하 저장

장기 보관 시 필수.

Light protection

광민감성 대사체 보호.

SOP 표준화

모든 샘플 동일 조건 적용.

Storage metadata 기록

채취 시간, 처리 시간, 보관 기간을 모두 기록.

결론

Metabolomics에서 측정되는 대사체는 단순한 화학 물질이 아니라 끊임없이 변화하는 동적 분자들이다. 따라서 샘플 채취 이후의 모든 과정은 생물학적 정보의 일부를 보존하거나 왜곡하는 역할을 한다.

실온 방치에 의한 glycolysis 진행, freeze-thaw에 의한 ATP 분해, 산화에 의한 glutathione 변화, 빛에 의한 비타민 분해, 장기 저장 중 지질 대사체 감소 등은 실제 임상 상태와 무관하게 metabolome을 바꿀 수 있다.

특히 위험한 점은 이러한 변화가 매우 그럴듯한 생물학적 해석을 만들어낸다는 것이다. Lactate 증가를 대사 재편성으로, GSSG 증가를 산화 스트레스로, ATP 감소를 미토콘드리아 기능 저하로 해석할 수 있지만 실제 원인은 샘플 보관 조건일 수 있다.

결국 Metabolomics 연구에서 가장 먼저 질문해야 할 것은 "무엇이 변했는가?"가 아니라 "언제부터 변하기 시작했는가?"일 수 있다. 많은 경우 대사체의 변화는 질병이 아니라 채혈 직후부터 이미 시작되고 있기 때문이다.

샘플 보관 조건이 Metabolomics 결과를 바꿔버리는 사례