Biologics + LC-MS/MS – 항체약물접합체(ADC) 대사체 분석 Workflow

1. 서론: Biologics와 ADC의 부상

바이오의약품은 지난 20년간 제약산업의 패러다임을 바꾸어왔다. 특히 항체약물접합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)는 항체의 표적 특이성과 저분자 세포독성 약물의 강력한 효력을 결합한 차세대 항암 치료제로 각광받고 있다. 단순 항체치료제(monoclonal antibody)와 달리, ADC는 항체에 payload(세포독성 화합물)를 링커(linker)를 통해 공유결합으로 연결한 구조를 가진다. 이로써, 표적 세포에 항체가 결합하면 리소좀 내에서 ADC가 분해되며 payload가 방출되어 세포사멸을 유도한다.

그러나 이러한 구조적 복잡성은 분석학적 과제(analytical challenge)를 야기한다. 즉, 항체, 링커, payload가 모두 다른 물리·화학적 특성을 가지기 때문에, 일반적인 생체분석(bioanalysis) 접근만으로는 약동학(PK), 대사체학, 안정성(stability)을 동시에 이해하기 어렵다. 특히, payload 및 그 대사체의 정량, 링커 안정성 평가, 항체 무결성 유지 여부, drug-to-antibody ratio (DAR) 변화 추적은 ADC 개발에서 핵심적인 과제이다.

이러한 이유로 최근에는 LC-MS/MS 기반 ADC 분석 workflow가 집중적으로 연구되고 있다. ADC의 대사체 및 분해산물을 정확히 정량하고, 임상 샘플에서의 동태를 추적하는 데 LC-MS/MS는 여전히 가장 강력한 도구로 평가된다.

Biologics + LC-MS/MS – 항체약물접합체(ADC) 대사체 분석 Workflow

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2. ADC의 구조적 특징과 분석상의 도전 과제

2.1. 구조적 특징

ADC는 세 가지 주요 구성 요소를 가진다:

1. Monoclonal antibody (mAb) – 종양 특이 항원을 인식하는 고분자 단백질
2. Linker – 항체와 payload를 결합시키는 화학적 다리
3. Payload (cytotoxic drug) – 강력한 세포독성 저분자 약물, 예: MMAE (monomethyl auristatin E), DM1 (maytansinoid) 등

2.2. 분석의 난점

• 이질성(heterogeneity): ADC는 동일한 항체라 하더라도 부착된 payload의 개수가 다르다. DAR 값이 0~8 범위에서 분포하며, 평균 DAR을 평가해야 한다.
• 복합 분해 경로: 혈중 및 조직 내에서 ADC는 다양한 경로로 대사된다. (1) 항체 degradation, (2) linker cleavage, (3) payload 대사체 생성.
• 저농도 문제: Payload와 대사체는 항체 대비 농도가 매우 낮아, 고감도 LC-MS/MS 분석이 필수적이다.
• 시료 복잡성: 혈장, 종양 조직, 간 homogenate 등 다양한 matrix에서 신뢰성 있는 분석법을 수립해야 한다.

 

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3. ADC 대사체 분석에서 LC-MS/MS의 역할

ADC 분석에는 다양한 기법이 사용되지만, payload 및 대사체의 정량적 추적에 있어 LC-MS/MS가 가장 유용하다. 그 이유는 다음과 같다:

• 높은 선택성: 항체 및 내인성 성분이 존재하는 복잡한 matrix에서도 payload 신호를 분리 가능.
• 정량 정확도: Stable isotope-labeled internal standard(SIL-IS)를 활용해 matrix effect 보정 가능.
• 다중 분석: 복수의 payload 대사체를 동시에 모니터링 가능.

특히, LC-MS/MS는 released payload 분석에 최적화되어 있다. 즉, 항체에서 떨어져 나온 활성 대사체를 추적하여 실제 세포 독성 발현과 연결짓는 것이다.

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4. ADC 대사체 분석 Workflow

4.1. 시료 전처리 단계

ADC 분석에서 가장 중요한 것은 matrix 내 다양한 형태의 분석 대상(항체-결합형, 자유형 payload, 대사체)을 효과적으로 분리하는 것이다. 일반적으로 다음과 같은 workflow가 적용된다.

1. Protein precipitation (PPT): 혈장 단백질 제거 후 payload 추출
2. Solid-phase extraction (SPE): 극성/비극성 분획 분리
3. Enzymatic digestion: 항체 단백질 분해 후 payload-conjugated peptide 분석
4. Immunocapture: 항체 특이적 capture 후 LC-MS/MS 분석

4.2. LC 조건 최적화

• Nano-LC 및 UHPLC 활용: 소량 시료에서 초고감도 분석 가능
• Hydrophilic interaction chromatography (HILIC): 극성 payload 분리에 유리
• Reversed-phase LC: 소수성 payload 분리에 일반적으로 사용

4.3. MS 검출 전략

• MRM (Multiple Reaction Monitoring): 가장 널리 쓰이는 방식, payload 및 대사체 선택적 정량
• HRMS (High-resolution MS): unknown 대사체 규명 및 구조 동정에 유리
• MS/MS fragmentation: payload-specific fragment ion 추출로 선택성 강화

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5. 대사체 분류 및 분석 전략

ADC 대사체는 크게 다음 네 가지로 나눌 수 있다:

1. Intact ADC: 항체에 payload가 부착된 상태
2. Deconjugated antibody: payload가 떨어져 나간 항체
3. Released payload: 혈중 및 조직 내 자유형 cytotoxic drug
4. Modified payload metabolites: hydroxylation, glucuronidation 등 대사 변형체

이 중 임상적으로 가장 중요한 것은 released payload와 그 대사체이다. Payload 농도가 독성 프로파일과 직접적으로 연관되기 때문이다. 예를 들어 MMAE 기반 ADC의 경우, 혈중 자유 MMAE 농도는 **말초신경병증(peripheral neuropathy)**과 상관성이 보고되었다.

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6. 국내외 사례 비교

6.1. 해외 사례

• Brentuximab vedotin (Adcetris®): MMAE payload의 혈중 대사체를 LC-MS/MS로 모니터링, 독성 관련성 평가.
• Trastuzumab emtansine (T-DM1): LC-MS/MS 기반 DM1과 대사체 정량, 종양 조직 내 축적 평가.

6.2. 국내 사례

한국 제약사들도 ADC 개발에 적극 나서고 있다. 한미약품, 셀트리온, 알테오젠 등이 ADC 플랫폼 기술을 확보하고 있으며, 이들 연구개발 과정에서 LC-MS/MS 기반 bioanalytical workflow 구축이 핵심 과제로 보고된다. 특히, 국내 분석연구실에서는 payload 대사체의 초저농도 정량을 위한 nano-LC-MS/MS 플랫폼 개발이 활발하다.

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7. Method Validation (FDA/EMA 가이드라인 기반)

ADC 분석법도 일반적인 소분자 bioanalysis validation 항목을 준수해야 한다.

• Selectivity & specificity
• Linearity & calibration curve
• LLOQ (Lower limit of quantification)
• Accuracy & precision
• Stability (freeze-thaw, benchtop, processed sample stability)

그러나 ADC 특성상, 항체 결합형 vs 자유 payload 간 구분 정량이 핵심 validation 포인트로 추가된다.

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8. 고급 전략: Hybrid LBA-MS 접근

최근에는 Ligand Binding Assay (LBA)와 LC-MS/MS를 결합하는 하이브리드 접근이 활용된다.

• LBA 단계: ADC 항체를 선택적으로 immunocapture
• LC-MS/MS 단계: 항체-부착 payload 및 released payload 동시 분석
  이 방식은 높은 선택성과 정량 정확도를 동시에 확보할 수 있다.

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9. 향후 전망

• Spatial metabolomics + LC-MS/MS imaging: 종양 내 payload 분포 시각화 가능
• Micro-sampling 기반 PK 분석: 환자군 맞춤형 TDM 플랫폼으로 확장
• AI-driven MS data mining: unknown metabolite 자동 검출 및 구조 제안

ADC는 향후 항암제 시장에서 가장 빠르게 성장할 영역 중 하나이며, LC-MS/MS 기반 bioanalysis는 그 핵심을 차지할 것이다. 특히 payload 대사체의 정량은 임상 독성 예측, 환자군 최적화 치료, drug repositioning 전략과도 연결된다.

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10. 결론

항체약물접합체(ADC)의 복잡성은 제약사 및 분석연구자들에게 큰 도전 과제이지만, 동시에 새로운 분석 패러다임을 요구한다. LC-MS/MS는 ADC의 대사체 분석에 있어 여전히 가장 강력하고 필수적인 플랫폼으로, payload 및 그 대사체의 정량, 링커 안정성 추적, DAR 변화 모니터링 등 다양한 영역에서 활용 가능하다.

궁극적으로 ADC 분석에서 LC-MS/MS는 단순한 정량 기법을 넘어, 임상 독성 관리, 환자 맞춤형 치료 전략, 신약개발 가속화를 가능케 하는 핵심 도구가 될 것이다.