1. 서론: Extraction Recovery가 왜 중요한가?
약물 분석에서 가장 중요한 목표 중 하나는 시료 내에 존재하는 약물을 정확하고 정밀하게 정량하는 것이다. 이때 시료 내의 분석 대상 물질을 효과적으로 추출하지 못하면, 실제 존재하는 농도보다 낮은 수치로 측정되거나 분석 간 오차가 커지는 문제가 발생한다. 이로 인해 약물동태학(PK), 생물학적 동등성(BE), 독성 시험 등 모든 후속 연구의 신뢰성이 크게 저하될 수 있다.
‘Extraction Recovery’는 전처리 과정을 거쳐 분석 대상 성분이 실제로 얼마나 추출되었는가를 나타내는 지표다. LC-MS/MS 기반 분석에서는 이 수치가 특히 중요하다. 높은 회수율(recovery)을 유지하면서도 정량성과 재현성을 확보할 수 있는 전처리 방법을 구축하는 것이 분석법 개발의 핵심이 된다.
2. Extraction Recovery의 정의와 평가 방법
2.1 정의
Extraction Recovery는 다음 수식으로 정의된다.
즉, 시료를 전처리한 후의 분석 대상 물질의 피크 면적을, 동일 농도의 물질을 추출 후 시료에 첨가한 것과 비교하여 얼마나 회수되었는지를 수치로 표현한다.
2.2 평가 방법
- Pre-extraction spiking: Matrix(혈장 등)에 약물을 첨가한 뒤 전처리 후 LC-MS/MS 분석
- Post-extraction spiking: Matrix에서 추출한 뒤 동일한 농도의 약물을 첨가하여 분석
- Neat standard: 용매에 직접 약물을 용해시켜 분석
세 그룹의 분석값을 비교함으로써 recovery와 matrix effect를 동시에 평가할 수 있다.
3. 전처리 방식별 Recovery에 미치는 영향
3.1 Protein Precipitation (단백질 침전법)
- 장점: 빠르고 간편하며 자동화가 용이
- 단점: 불순물 제거가 불완전하여 matrix effect가 큼
Recovery가 낮은 경우가 많고, 약물의 단백질 결합률이 높으면 추출 손실이 발생한다.
개선 전략:
- Acetonitrile 대신 Methanol+Formic acid 혼합 용매 사용
- 침전 후 2차 정제(SPE 등) 병용
3.2 Liquid–Liquid Extraction (액-액 추출)
- 장점: 선택성이 높고 불순물 제거에 효과적
- 단점: 작업자의 숙련도, pH 설정에 따라 회수율 편차 존재
개선 전략:
- pH 조절을 통해 비이온화 상태로 만들고 유기용매로 이동 유도
- DCM(디클로로메탄) + IPA(이소프로판올) 같은 혼합 용매 활용
3.3 Solid Phase Extraction (SPE)
- 장점: 높은 회수율과 재현성 확보 가능
- 단점: 카트리지 종류, 조건 설정에 따른 최적화 필요
개선 전략:
- Mixed-mode SPE (C18 + SCX 등) 사용으로 극성/비극성 동시 처리
- Washing 단계에서 잔류 불순물 제거 최적화 (5% MeOH 등)
4. 약물 특성별 Recovery 향상 전략
4.1 고지용성 약물
- 단백질과 강하게 결합하거나 matrix에 흡착되는 경향
- Tip: 비이온계 계면활성제 (Tween 20, Triton X-100 등) 추가하여 흡착 억제
4.2 극성 약물 (친수성)
- 유기용매에 용해되지 않아 LLE 효율 저하
- Tip: pH 조절을 통해 이온화 상태 조절, 극성 유기용매(IPA, ACN) 조합 사용
4.3 산성/염기성 약물
- 약물의 pKa 값 기반으로 전하 상태 변화 → 추출 효율 결정
- Tip: pH 범위 내에서 중성 상태로 조절하여 용매 상 이동 유도
5. Matrix 종류에 따른 전처리 최적화
5.1 혈장(Plasma) 또는 혈청(Serum)
- 단백질, 인지질 등 다량 포함 → matrix effect 극심
- SPE나 Hybrid-SPE를 활용하여 인지질 제거 필수
5.2 소변(Urine)
- matrix 영향은 적으나 희석도가 높음 → 농축 필요
- LLE + 재용해 방식으로 sensitivity 향상 가능
5.3 조직균질액(Tissue Homogenate)
- 다양한 효소 및 지방 존재 → 회수율 편차 크고 처리 복잡
- 전처리 전 Homogenization 방법 표준화 필요 (초음파 or Mechanical)
6. Recovery 향상을 위한 실험 설계 전략 (DoE 적용)
- Factorial Design을 활용하여 추출 변수의 상호작용 분석
- 주요 변수:
- 침전용매 종류
- pH 조건
- 용매 부피
- vortex 시간 및 speed
- 원심분리 조건
예시:
- pH 6.0, Methanol 4배량, 10분 vortex → 65% → 개선
- pH 5.0, Methanol+Formic acid 1% → 93% 회수율 도달
7. 실제 적용 사례
7.1 항암제 A의 회수율 개선 사례
- 초기 회수율: 48% (단백질 침전법 사용)
- 개선 전략: Methanol + 0.1% Formic acid → 76%
- 최종 전략: SPE 도입 후 91% 확보
7.2 고분자 약물의 회수율 최적화
- 단백질 침전 시 대부분 소실됨
- 온도 조건 조절(4°C 보관), 회수율 60% → 88%로 향상
8. 자동화 시스템과의 연계 방안
- 전처리 자동화 장비 (Tecan, Hamilton 등)를 통해 일관성 확보
- SPE 카트리지 자동 세팅 기능 포함 시 재현성 대폭 향상
- LC-MS/MS의 Front-end를 자동화 시스템과 직접 연계하여 전체 분석 효율화
9. 결론: 회수율 개선은 정량 분석의 신뢰성을 높이는 핵심
LC-MS/MS 기반 약물 분석에서 정확한 정량은 분석법 전체의 성공을 좌우한다. 특히, Extraction Recovery는 시료 채취 이후의 모든 분석 결과의 기반이 되는 만큼, 이를 향상시키기 위한 전략은 단순 기술적인 문제가 아니라 품질관리(QC), 규제 대응, 글로벌 임상 데이터 신뢰성 확보 등 전방위에 걸쳐 영향을 준다.
전처리 조건의 미세한 차이가 실제 임상시험 데이터 해석에 영향을 줄 수 있기 때문에, 분석법 개발 초기 단계부터 Extraction Recovery 최적화는 필수적이다. 또한 Matrix 종류, 약물의 물리화학적 특성, 장비 구성에 따라 다양한 방법론이 적용될 수 있으므로, 단일 방법에 의존하기보다는 **데이터 기반의 설계적 접근(DoE)**을 통한 지속적인 개선이 요구된다.
📊 실험 예시 데이터 추가
표 1. 전처리 방식별 Extraction Recovery 비교 (항우울제 계열 약물, Human Plasma 기준)
| 단백질 침전 (ACN) | 58.2 | 9.5 | -22.3 | 침전 후 상층액만 분석 |
| 단백질 침전 (MeOH) | 62.9 | 7.8 | -18.1 | MeOH + 0.1% FA 첨가 |
| LLE (Ethyl acetate, pH 7) | 78.3 | 6.4 | -9.2 | pH 조절 후 추출 |
| SPE (C18 카트리지) | 91.6 | 3.2 | -3.5 | 최적화된 washing 적용 |
| Hybrid-SPE (Phospholipid 제거) | 93.4 | 2.9 | -1.7 | 인지질 제거 효과 우수 |
🔍 해설: Hybrid-SPE 방식이 회수율과 Matrix Effect 측면에서 가장 우수한 성능을 보였으며, 특히 반복 측정 시 RSD가 3% 이하로 우수한 재현성을 나타냄.
표 2. 약물 pKa 특성에 따른 pH 조절 실험 결과 (NSAID 계열 약물, Plasma)
| Ibuprofen (pKa ≈ 4.5) | 45.6 | 82.1 | pH 3.5로 산성화하여 비이온화 상태 유도 |
| Naproxen (pKa ≈ 4.2) | 48.9 | 85.3 | pH 3.0에서 최대 회수율 확보 |
| Ketoprofen (pKa ≈ 4.0) | 42.5 | 81.6 | 전처리 전 완충용액 조정 |
🔍 해설: pKa 값을 고려해 matrix를 산성화한 경우, 지용성 증가로 LLE 효율이 크게 향상됨. 비이온화 상태에서 유기용매로의 이동성이 높아짐.
표 3. 자동화 시스템 도입 전후 회수율 및 재현성 비교 (항당뇨제, LC-MS/MS 분석)
| 수작업 (Manual SPE) | 88.4 | 6.9 | 7시간 |
| 자동화 시스템 (Tecan 기반 SPE) | 91.2 | 3.1 | 3.5시간 |
🔍 해설: 자동화 시스템 도입으로 회수율이 향상되었을 뿐 아니라, RSD가 절반 이하로 줄어듦. 고속 처리 가능으로 대량 분석에 유리.
표 4. 약물농도에 따른 Recovery 선형성 확인 (혈장 내 항생제)
| 10 | 85.2 | 5.1 |
| 100 | 87.6 | 3.4 |
| 1000 | 89.1 | 2.7 |
🔍 해설: 분석 범위 내에서 회수율이 일정한 수준으로 유지되며, 선형성이 확보됨. 이는 분석법의 적합성과 안정성을 나타냄.
부록: 회수율 개선 전/후 비교 요약
| 전처리 방법 | Protein Precipitation (ACN) | Hybrid-SPE + pH 조절 |
| 회수율 (%) | 58.2 | 93.4 |
| RSD (%) | 9.5 | 2.9 |
| 분석 가능 농도범위 | 50–500 ng/mL | 10–1000 ng/mL |
| Matrix effect | -22.3% | -1.7% |
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