유효성분 및 대사체 동시 분석 전략 – LC-MS/MS 기반 복합 분석법 개발

의약품 개발에서 유효성분(active pharmaceutical ingredient, API)뿐만 아니라, 그 대사체(metabolites)의 정확한 분석은 약효, 독성, 약물 상호작용 등을 총체적으로 이해하는 데 핵심적인 단계입니다. 특히 최근에는 대사체의 활성 또는 독성 기여가 강조되면서, API와 대사체를 동시에 정량하는 복합 분석법(combined quantification method)의 필요성이 높아지고 있습니다. 본 글에서는 LC-MS/MS 기반으로 유효성분과 대사체를 동시에 분석하기 위한 실무 전략, 분석법 개발 과정, 검증 요건, 실무에서의 문제 해결 방안 등을 구체적으로 다루고자 합니다.

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1. 동시 분석의 필요성과 과제

1-1. 왜 동시 분석이 중요한가?

• 약물 전체 동태 파악: 유효성분 단독 분석으로는 부족한, 체내 대사 이후의 약물 운명을 총체적으로 파악 가능
• 활성 대사체 고려: 일부 대사체는 원약보다 강력한 약리활성을 지니므로, 동시 분석을 통한 정확한 노출량 추정이 중요함
• 독성 대사체 감시: 특정 대사체가 독성 유발 가능성을 가질 경우, 조기 탐지가 필요
• 규제 기관 요구 충족: FDA나 EMA는 신약 심사 과정에서 주요 대사체의 노출량 자료를 요구하고 있어, 동시 분석법이 필수적인 상황이 많음

1-2. 실무상의 도전과제

• 물리화학적 특성 차이: API와 대사체의 극성, 분자량, 이온화 특성이 상이하여 동시 분석 조건 설정이 어려움
• 농도 차이: 원약은 고농도로 존재하고 대사체는 극미량 존재하는 경우가 많아, 정량 범위(dynamic range)의 확보가 중요
• 동시 추출 효율 문제: 전처리 조건에 따라 API 또는 대사체 중 한쪽이 회수율이 낮아지는 경우가 존재함
• 동시 정량 시 간섭 가능성: MRM 전이 간섭, retention time 겹침, 이온 억제 등 다성분 분석 시 필연적으로 따라오는 간섭 이슈 발생 가능

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2. LC-MS/MS 기반 복합 분석법 설계

2-1. 전처리 전략 선택

• 단일 단백질 침전법 (PPT): 유효성분과 대사체 모두 단백질 결합력이 낮을 경우 유용. 빠르고 간편하지만 matrix effect가 높을 수 있음
• 액액 추출법 (LLE): 대사체와 API의 극성 차이가 클 경우 선호됨. 선택적 분리가 용이하며, 지용성 API와 수용성 대사체 동시 분리 가능
• 고체상 추출법 (SPE): 고순도 분석 필요 시, 다양한 카트리지를 적용해 선택적으로 API 및 대사체 동시 정제 가능

실무 팁: 대사체가 glucuronide 혹은 sulfate conjugate 형태로 존재하는 경우, 효소 처리(Hydrolysis)를 통해 자유형(free form)으로 변환한 뒤 분석하는 전략이 실용적입니다.

2-2. 크로마토그래피 조건 설계

• 컬럼 선택: C18 컬럼은 일반적인 선택이지만, 대사체의 극성이 클 경우 HILIC, phenyl-hexyl, mixed-mode 컬럼도 적극 검토
• Gradient 설정: API와 대사체가 극단적으로 다른 용리 시간을 보일 경우, 두 성분을 모두 커버할 수 있는 gradient 조정 필요. 초기 용리 시간과 컬럼 equilibration 시간이 충분히 확보되어야 반복 분석 간 재현성이 보장됨
• Injection volume 조절: 대사체가 극저농도일 경우, injection volume을 증가시켜 감도 확보 가능하지만 peak broadening 방지를 위한 컬럼 과부하 주의 필요

2-3. 질량분석기 파라미터 최적화

• MRM 전이 선정: 각 물질의 주요 전이(MRM transition)를 최대 2쌍 이상 확보해 선택성과 감도를 동시에 보장. Product ion 선택 시 특이적인 fragment 확보 중요
• 이온화 모드 분리: 경우에 따라 유효성분은 양이온 모드(+), 대사체는 음이온 모드(-)에서 감도가 높을 수 있음 → polarity switching 필요 여부 고려
• Dwell time 설정: 성분 수가 많아질 경우, dwell time이 짧아져 감도가 저하될 수 있으므로, 핵심 성분 우선순위에 따라 time-scheduled MRM 적용

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3. 분석법 밸리데이션 고려사항

3-1. 정량범위 설정 (LLOQ ~ ULOQ)

• API는 상대적으로 높은 농도, 대사체는 극저농도일 수 있으므로, 넓은 정량 범위 확보가 필요
• 이때 신호 선형성(linearity)을 양쪽 성분 모두에서 확보해야 하므로, calibration curve 구성을 정교하게 설계해야 함
• 검량선은 matrix-matched 방식으로 구성할 경우, matrix effect에 의한 bias를 최소화할 수 있음

3-2. 정확도와 정밀도

• 각 물질별로 intra-day, inter-day precision 및 accuracy를 개별 평가
• 대사체의 경우 matrix에서의 간섭이 심할 수 있으므로, matrix-matched calibration 필수
• 검증 시 고/중/저농도 QC 시료는 반드시 API 및 대사체 모두에 대해 개별 구성

3-3. 안정성 시험

• 대사체의 경우, freeze-thaw stability나 bench-top stability가 API보다 낮은 경우가 많음
• 특히 phase II 대사체(conjugated metabolites)는 해리되기 쉬워, 반복 해동 및 저장 온도 변화에 취약
• 공동 안정성(co-stability) 평가 외에도, 각 성분의 long-term stability 및 extract stability를 독립적으로 확보할 것

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4. 복합 분석 시 실무적 문제 해결 사례

사례 1: 대사체 peak이 겹치는 문제

• 문제 원인: 대사체가 API와 유사한 분자 구조를 가지며, retention time이 비슷하여 peak 간섭 발생
• 해결 방안: gradient 시간 조정 및 컬럼 종류 변경 (예: C18 → phenyl-hexyl). 필요 시 2D-LC 기술 적용 고려

사례 2: 대사체 농도가 LLOQ 이하로 측정됨

• 문제 원인: 대사체 농도가 매우 낮거나, 전처리 회수율 저하
• 해결 방안: 분석 시료량 증가 또는 선택적 전처리 방법(SPE로 농축 후 분석) 적용. LC injection loop 세척을 철저히 하여 carry-over 방지

사례 3: Polarity switching 시 감도 저하 발생

• 문제 원인: 양이온-음이온 전환 시 dwell time 손실 및 ion source 안정성 저하
• 해결 방안: 가능하면 동일 이온화 모드에서 MRM 전이를 최적화하거나, time segment를 나누어 성분 별 감도 최적화 시도

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5. 결론 및 향후 고려사항

API와 대사체를 동시에 분석하는 전략은 단순한 기술적 도전을 넘어, 약물의 전체 동태에 대한 통합적 접근을 가능하게 해줍니다. 복합 분석법을 개발할 때에는 시료 전처리, 크로마토그래피, 질량분석기 세팅, 밸리데이션 요건 등 다양한 측면에서의 다층적 고려가 필요하며, 특히 각 성분의 물리화학적 특성 차이를 고려한 세심한 설계가 중요합니다.

글로벌 규제 기관은 점점 더 대사체 데이터의 제출을 요구하고 있으며, 이를 위해서는 복합 분석법의 정밀도, 정확도, 안정성 평가가 필수적으로 동반되어야 합니다. 실무에서는 기술적 정밀함뿐 아니라 문서화의 일관성과 재현성 있는 결과 보고가 요구되므로, 초기부터 검체 처리, 장비 세팅, 데이터 처리까지 전 과정에 대한 표준화가 권장됩니다.

또한, 신약 파이프라인이 점점 더 복잡한 구조의 후보 물질을 포함하게 되면서, 단일 물질 분석이 아닌 다성분 분석이 필수가 되어가고 있습니다. 따라서 분석실에서는 이러한 복합 정량 기술을 내재화하고, 분석자 간의 SOP 공유와 훈련, 분석 시스템 간 교차 검증 등의 절차도 병행되어야 할 것입니다.

유효성분 및 대사체 동시 분석 전략 – LC-MS/MS 기반 복합 분석법 개발