LC-MS/MS 기반 정량 분석에서 Matrix Effect 최소화 전략

서론: Matrix Effect, 무시할 수 없는 변수

LC-MS/MS 기반 정량 분석에서 Matrix Effect 최소화 전략

 

LC-MS/MS는 의약품 정량 분석에서 가장 널리 사용되는 기술 중 하나로, 특히 생체시료(혈장, 혈청, 뇌척수액 등) 내 극미량 약물의 정밀 정량에 탁월한 성능을 보여준다. 그러나 분석의 정확성과 신뢰도를 위협하는 대표적인 장애 요인 중 하나가 바로 Matrix Effect이다. 시료 내 다양한 내재 물질들이 분석 과정에서 이온화 효율에 영향을 미치며, 결과적으로 신호 증강 혹은 신호 억제가 발생할 수 있다.

Matrix Effect는 단순히 실험 오차의 원인을 넘어, 허위 음성(false negative) 또는 허위 양성(false positive) 결과로 이어질 수 있으며, 이는 규제기관의 자료 반려 및 임상 실패로 이어질 수 있는 심각한 문제로 확장된다.

본 글에서는 LC-MS/MS 기반 생체시료 정량 분석 시 발생할 수 있는 Matrix Effect의 원인, 평가법, 그리고 그를 최소화하기 위한 실질적인 전략을 상세하게 살펴본다. 또한, 실제 실무에서 활용되고 있는 해결 전략 및 제약업계의 사례를 함께 제시함으로써, 분석 실무자들이 직면한 문제를 구체적으로 해결할 수 있도록 돕고자 한다.

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1. Matrix Effect의 정의와 발생 메커니즘

Matrix Effect란, 분석 대상 물질(Analyte) 외의 성분들이 전기분무 이온화(ESI) 과정 중 이온화 효율을 방해하거나 증폭시키는 현상을 말한다. 주로 혈장, 뇌척수액, 소변 등 생체시료에서 나타나며, 그 원인은 다음과 같이 정리된다.

1.1 주요 원인

• 인지질, 단백질 분해물, 염 등 내재 물질
• 공정 중 잔류 시약 또는 용매
• 추출 효율 차이로 인한 선택적 공존 물질
• Column bleed 혹은 mobile phase 내 불순물

1.2 이온화 억제 vs 이온화 증강

• 이온화 억제 (Suppression): 주입된 용액 내 비휘발성 물질이 ESI 노즐에서 이온화를 방해하여 신호가 감소
• 이온화 증강 (Enhancement): 공존 물질이 Analyte의 이온화를 촉진시켜 신호가 비정상적으로 증가

1.3 주요 영향 지점

• 분석 결과의 정밀도 및 정확도 저하
• LLOQ 도달 실패로 인한 method sensitivity 저하
• Calibration curve linearity 저하
• Inter-lot, inter-subject variability 증가

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2. Matrix Effect 평가 방법

효과적인 개선 전략 수립을 위해서는 먼저 Matrix Effect의 존재와 강도를 객관적으로 평가하는 것이 필요하다. 일반적으로 다음 세 가지 방식이 사용된다.

2.1 Post-column infusion 방법

Analyte 용액을 일정한 속도로 지속적으로 LC-MS/MS에 주입하는 동시에 blank matrix를 chromatographic 조건에 따라 주입하여, 신호가 억제되는 지점(ion suppression zone)을 확인하는 방법이다.

• 장점: retention time에 따른 matrix 효과 구간을 시각적으로 파악 가능
• 단점: 정량화는 불가능, 정성적 방법

2.2 Post-extraction spike 방법 (Matuszewski 방법)

• Blank matrix에서 추출한 용액에 Analyte를 spike한 후의 신호를, 같은 농도의 순수 용매(Neat solution)에 spike한 신호와 비교
• Matrix Factor(MF) 계산:
  MF = (Peak area in matrix extract) / (Peak area in neat solution)
• 1에 가까울수록 Matrix Effect가 적음
• 85~115% 이내일 경우 허용 가능

2.3 IS-normalized Matrix Factor

내부표준물질(IS)을 이용한 보정 방법
IS-MF = MF(Analyte) / MF(IS)

내부표준물질 역시 matrix 영향을 받기 때문에, 이를 통해 보정 가능성 판단

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3. Matrix Effect 최소화를 위한 핵심 전략

3.1 시료 전처리 최적화

Matrix Effect를 줄이기 위한 첫 번째 단계는 적절한 시료 전처리 방식의 선택이다.

3.1.1 단백질 침전(Protein Precipitation, PPT)

• 가장 간단하고 빠르지만 matrix 제거 능력은 낮음
• 주로 초기 스크리닝 또는 고농도 분석에 사용

3.1.2 액체-액체 추출(Liquid-Liquid Extraction, LLE)

• 선택적 matrix 제거 가능
• 유기용매 선택, pH 조절 등으로 효율 극대화

3.1.3 고체상 추출(Solid Phase Extraction, SPE)

• Matrix 제거 능력이 가장 뛰어남
• 시료의 극성, pKa 등에 따라 카트리지 종류 선택

실무 팁: ESI 사용 시, 인지질 제거에 특화된 SPE(SLE+ or phospholipid removal column)를 적용하면 효과적이다.

3.2 LC 분리 조건 개선

3.2.1 컬럼 선택

• C18 이외에도 HILIC, phenyl-hexyl 등 특이성이 높은 컬럼 사용
• Retention time을 matrix interference가 적은 지점으로 이동 가능

3.2.2 Gradient 및 Mobile Phase 조정

• pH 조절로 이온화 형태 변경
• Volatile salt(NH₄Acetate, NH₄Formate 등) 활용
• Organic phase 비율 조정으로 분리능 강화

3.2.3 주입량 최적화

• Matrix 유입량 감소를 위한 injection volume 최소화 전략
• 일반적으로 1~5 μL가 적당하며, 농축 필요 시 SPE 병행

3.3 Mass 조건 최적화

• Ion source의 온도, gas flow rate 조정으로 이온화 효율 향상
• SIM, MRM 전환을 통한 interference 최소화

3.4 내부표준물질(IS) 전략

• Matrix Effect 보정에 가장 중요한 도구
• Stable isotope-labeled IS 사용 시 가장 정확한 보정 가능
• Peak area ratio 기준으로 데이터 처리 시 reproducibility 향상

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4. 실무 적용 사례

4.1 Case 1: 소아 혈장 시료에서의 Matrix 억제 극복

• 배경: 소아환자 대상 희귀질환 치료제 분석 시, 혈장 50 μL에서의 정량 필요
• 문제: 단백질 침전 사용 시 약물 신호의 40% suppression 확인
• 해결: LLE로 전처리 방식 변경 → Matrix Factor 0.6 → 0.95로 개선

4.2 Case 2: 지질 간섭 극복을 위한 SPE 최적화

• 배경: 고지혈증 환자 대상 약물 분석 시, 인지질 간섭 다수 발생
• 해결: Hybrid-SPE 필터 사용 및 washing step 강화
• 결과: 신호 안정성 향상 및 inter-subject variability 감소

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5. 규제기관 기준과 Matrix Effect 관리

5.1 FDA 가이드라인 (FDA Bioanalytical Method Validation Guidance)

• Matrix Effect 평가는 필수 항목으로 간주
• 최소 6개 이상의 개별 매트릭스에서 평가
• %CV 15% 이내, 정량 편차 ±15% 이내 요구

5.2 EMA 가이드라인

• Matrix Factor의 IS-normalized 값 권장
• 다양한 matrix source 사용 권고 (e.g., haemolysed, lipemic 등)

5.3 MFDS 기준

• 국내 기준은 FDA, EMA에 기반하며, Matrix Factor 수치 외에도 IS 선택과 분석법 재현성까지 검토 대상

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6. 최신 기술과 자동화 적용

6.1 온라인 전처리 시스템

• Online-SPE, Turboflow 방식 등은 자동화와 함께 Matrix 제거 기능 강화
• Sample throughput 증가에도 유리

6.2 Ion mobility spectrometry (IMS) 접목

• 동일한 m/z 값을 가지는 interference 제거 가능
• MS/MS 외의 추가 분리 단계 확보

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7. 결론: “Matrix와의 전쟁은 곧 데이터의 신뢰성과 싸움이다”

Matrix Effect는 단순한 분석 장애 요인을 넘어, 분석의 신뢰성 자체를 좌우하는 변수이다. 특히 규제기관의 기준이 점점 정밀해지고, 극미량 분석이 일상이 된 현재, 이를 제어하지 못한 채 분석법을 운영하는 것은 매우 위험한 접근이라 할 수 있다.

정량 분석에서의 핵심은 “의심 없이 신뢰할 수 있는 데이터”이며, 이를 위해 Matrix Effect를 객관적으로 평가하고 체계적으로 최소화하는 전략이 필수적이다.

앞으로도 LC-MS/MS 기반 분석은 계속 진화할 것이며, 그 중심에는 전처리, 분리, 보정 전략의 정교화가 자리할 것이다. 결국, 분석팀이 얼마나 섬세하게 이 ‘보이지 않는 변수’들을 다루느냐가, 제약 개발의 전체 여정을 좌우하는 가장 현실적인 차이가 될 것이다.